Die Isolierung oder Anreicherung kleiner dispergierter Regionen von Interesse aus FFPE oder frischem Tiefkühlmaterial kann mit automatisierter Dissektion schneller und effizienter als mit herkömmlichen Methoden erreicht werden. Die Extraktion von genomischem Material aus FFPE oder frischem gefrorenem Gewebe ist eine Voraussetzung für viele klinische und translationale Forschungslabors. Die automatisierte Dissektion füllt eine signifikante Lücke zwischen Makrodissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion.
Kommentieren Sie zunächst die gescannten Folienbilder für die interessierenden Tumorregionen mit einer vom Anbieter bereitgestellten Anzeigeplattform oder einem Open-Source-Viewer. Platzieren Sie den unbefleckten Objektträger auf dem Tisch in der ersten bis vierten Objektträgerposition, wenn Sie eine digitale Objektträgerreferenz verwenden. Erstellen Sie einen Fräsauftrag mit der automatisierten Gewebedissektionssoftware, indem Sie die Auftragsliste öffnen, dann Neuen Auftrag erstellen auswählen und die Fall-ID und den Namen eingeben, um den Namen des Auftrags einzugeben.
Wechseln Sie zu Dicke, und wählen Sie die Schnittstärke mithilfe der Pfeilregisterkarte nach oben oder unten aus. Gehen Sie dann zu Gewebepräparation und wählen Sie Paraffinisiert oder Deparaffinisiert. Wählen Sie "Referenzbild" aus der Datei und Bild importieren.
Wählen Sie dann die zu importierende Datei aus der Dropdown-Liste als digitale Referenz aus. Scannen Sie die Stufe, indem Sie die Schaltfläche "Scan-Stufe" in der unteren rechten Ecke auswählen, um jeden Probengewebeträger an der ersten bis vierten Position zu erfassen. Ziehen Sie für die Referenz auf der Bühne das Feld, um einen rechteckigen Bereich über dem Gewebe zu erstellen, und wählen Sie die kreisförmige Blase unter dem rechteckigen Bereich aus, um das Bühnenreferenzbild aufzunehmen.
Kopieren Sie dieses Rechteckfeld auf die verbleibenden Objektträger der Probe in der zweiten bis vierten Objektträgerposition, indem Sie die Kopieroption in der oberen rechten Ecke des Referenzbildes auswählen. Richten Sie dann die Größe aus und ändern Sie die Größe nach Bedarf. Überlagern Sie das Bild für das digitale Referenzbild auf dem ausgewählten rechteckigen Bereich.
Ändern Sie dann die Größe und richten Sie die digitale Referenz grob aus, natürlich zoomen, um sie am besten an die Größe und die Position über dem Probengewebe anzupassen. Kopieren Sie dieses Rechteckfeld auf die verbleibenden Objektträger der Probe in der zweiten bis vierten Objektträgerposition, indem Sie die Kopieroption in der oberen rechten Ecke des Referenzbildes auswählen. Richten Sie dann die Größe aus und ändern Sie die Größe nach Bedarf.
Wählen Sie die Schaltfläche "Scan-Phase" in der unteren rechten Ecke, um in den Feinjustierungsschritt zu gelangen. Wählen Sie die Position der ersten Stufe und das Symbol "Werkzeug transformieren" in der rechten Symbolleiste aus, um feine Ausrichtungs- und Zoomanpassungen der Referenz vorzunehmen, die am besten zur Beispielfolienüberlagerung passen. Verwenden Sie den Verweis auf die Sample-Schiebeleiste am unteren Bildschirmrand, und wechseln Sie zwischen den Referenz- und Sample-Bildern.
Und die Zoom- und Zoom-Out-Funktion, um die Ausrichtung jeder Folienposition anzupassen und zu erreichen. Sobald die optimale Probenüberlagerung erreicht ist, zeichnen Sie die Fräsbahnbezeichnungen auf den farbigen Teil des maskierten Referenzbildes, indem Sie das Farbauswahlwerkzeugsymbol in der rechten Symbolleiste auswählen. Zeichnen Sie die Fräspfade auf die Beispielfolien, indem Sie die Schaltfläche "Anmerkungen abrufen" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auswählen.
Erfassen und erfassen Sie den annotierten Bereich von Interesse mit vier oder weniger Frässpitzen, wenn der Fräsweg berechnet wird. Die Frässpitzennutzung in der oberen linken Ecke wird basierend auf der abgedeckten Fläche und der ausgewählten Spitzengröße berechnet. Die Spitzengröße kann unter dem Frässpitzenpfeil geändert werden, und die Spitzenverwendung wird neu berechnet.
Wenn der Fräspfad in der ersten Schlittenposition ausgewählt wird, wird er auf die verbleibenden Schlittenpositionen kopiert. Wählen Sie die Schaltfläche "Setup-Stufe" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, um die Frässpitzen aus den Auffangrohren in ihrer richtigen Bezeichnung auf der Bühne zeitnah zu laden. Füllen Sie das Reservoir mit drei Millilitern geeignetem Dissektionspuffer für den Gewebetyp und für die nachgeschaltete Nukleinsäureextraktion.
Wählen Sie dann die Schaltfläche "Sezieren" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms. Entfernen Sie nach der automatisierten Dissektion die Auffangröhrchen und die sezierten Probenobjektträger von der Bühne. Legen Sie die Auffangrohre in das Rohrgestell und die Schlitten in das Diagestell.
Die H & E-gefärbten Formalin, festes Paraffin eingebettet und frische gefrorene Mausleberabschnitte, die metastasierenden Darmkrebs in Xenotransplantaten enthielten, wurden auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung gescannt und als Referenzobjektträger verwendet. Die H&E-gefärbten Referenzobjektträger wurden für die Dissektion und Nukleinsäureextraktion mit Anmerkungen versehen und digital für Tumorregionen maskiert. Die nachsezierten Probenobjektträger wurden H & E gefärbt, um die Sezierbereiche in 10-Mikrometer- und 20-Mikrometer-Objektträgern zu bestätigen.
Erfasste Metriken zeigten den Erfolg der automatisierten Dissektion und Nukleinsäureextraktion. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass das Erreichen einer relativ genauen Überlagerung der Anmerkungen auf den unbefleckten Folien wichtig ist, um Interessenbereiche zu isolieren.
