El aislamiento o enriquecimiento de pequeñas regiones dispersas de interés a partir de FFPE, o material fresco congelado, se puede lograr con disección automatizada de manera más rápida y eficiente que con los métodos tradicionales. La extracción de material genómico de FFPE, o tejido fresco congelado, es un requisito para muchos laboratorios de investigación clínica y traslacional. La disección automatizada llena un vacío significativo entre la macrodisección y la microdisección de captura láser.
Para comenzar, anote las imágenes de diapositivas escaneadas para las regiones tumorales de interés, utilizando una plataforma de visualización proporcionada por el proveedor o un visor de código abierto. Coloque el portaobjetos de tejido de muestra no teñido en el escenario en la primera a la cuarta posición de la diapositiva cuando utilice una referencia de diapositiva digital. Cree un trabajo de fresado utilizando el software de disección automatizada de tejidos abriendo la lista de trabajos, luego seleccione Crear nuevo trabajo e ingrese el ID de caso y el nombre para ingresar el nombre del trabajo.
Vaya a Grosor y seleccione grosor de sección con la pestaña de flecha hacia arriba o hacia abajo. Luego, vaya a Preparación de tejidos y seleccione Parafinado o Desparafinado. Seleccione Imagen de referencia"Desde archivo e Importar imagen.
A continuación, seleccione el archivo que desea importar desde el menú desplegable como referencia digital. Escanee el escenario seleccionando el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para capturar cada diapositiva de tejido de muestra en la primera a la cuarta posición. Para la referencia en el escenario, arrastre el cuadro para crear un área rectangular sobre el tejido y seleccione la burbuja circular debajo del área rectangular para capturar la imagen de referencia del escenario.
Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario. Para la imagen de referencia digital, superponga la imagen en el área rectangular seleccionada.
Luego, cambie el tamaño y alinee la referencia digital bruscamente, en curso, haga zoom, para que coincida mejor con el tamaño y la posición sobre el tejido de la muestra. Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario.
Seleccione el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para pasar al paso de ajuste fino. Seleccione la posición de la primera etapa y el icono de la herramienta Transformar en la barra de herramientas de la derecha para realizar ajustes finos de alineación y zoom de la referencia para que coincida mejor con la superposición de diapositivas de muestra. Utilice la referencia a la barra deslizante de muestra en la parte inferior de la pantalla, alternando entre la referencia y las imágenes de muestra.
Y la función de acercar y alejar para ajustar y lograr la alineación de cada posición de la diapositiva. Una vez que se logre la superposición de muestra óptima, dibuje las designaciones de la ruta de fresado en la parte coloreada de la imagen de referencia enmascarada seleccionando el icono de la herramienta selector de color en la barra de herramientas de la derecha. Dibuje los trazados de fresado en las diapositivas de muestra seleccionando el botón Obtener anotaciones en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Capture y recoja la región anotada de interés con cuatro o menos puntas de fresado cuando se calcule la trayectoria de fresado. El uso de la punta de fresado en la esquina superior izquierda se calcula en función del área cubierta y el tamaño de la punta seleccionada. El tamaño de la punta se puede cambiar debajo de la flecha de la punta de fresado, y el uso de la punta se volverá a calcular.
Cuando se selecciona el trazado de fresado en la primera posición de diapositiva, se copiará en las posiciones de deslizamiento restantes. Seleccione el botón "Etapa de configuración" en la esquina inferior derecha de la pantalla para cargar rápidamente las puntas de fresado de los tubos de recolección en su designación adecuada en el escenario. Llene el depósito con tres mililitros de tampón de disección apropiado para el tipo de tejido y para la extracción de ácido nucleico aguas abajo.
Luego, seleccione el botón Diseccionar en la esquina inferior derecha de la pantalla. Después de la disección automatizada, retire los tubos de recolección y las diapositivas de muestra diseccionadas del escenario. Coloque los tubos de recogida en el bastidor de tubos y las correderas en el bastidor de diapositivas.
La formalina teñida de H&E, la parafina fija incrustada y las secciones de hígado de ratón frescas congeladas que contienen cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos se escanearon en una imagen de diapositiva completa con un aumento de 20x, y se utilizaron como diapositivas de referencia. Las diapositivas de referencia teñidas de H&E fueron anotadas y enmascaradas digitalmente para las regiones tumorales para la disección y la extracción de ácido nucleico. Las diapositivas de muestra post-diseccionadas fueron teñidas por H&E para confirmar las áreas de disección en diapositivas de 10 micrómetros y 20 micrómetros.
Las métricas capturadas demostraron el éxito de la disección automatizada y la extracción de ácidos nucleicos. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que lograr una superposición relativamente precisa de anotaciones en las diapositivas no manchadas es importante para aislar las áreas de interés.
