O isolamento ou enriquecimento de pequenas regiões dispersas de interesse da FFPE, ou material congelado fresco, pode ser alcançado com dissecção automatizada de forma mais rápida e eficiente do que com os métodos tradicionais. A extração de material genômico da FFPE, ou tecido congelado fresco, é um requisito para muitos laboratórios de pesquisa clínica e translacional. A dissecção automatizada preenche uma lacuna significativa entre a dissecção macro e a micro dissecção de captura a laser.
Para começar, anote as imagens de slides digitalizadas para as regiões de interesse do tumor, usando uma plataforma de visualização fornecida pelo fornecedor ou um visualizador de código aberto. Coloque o deslizamento de tecido amostral não manchado no palco da primeira à quarta posição de slide ao usar uma referência de slide digital. Crie um trabalho de moagem usando o software automatizado de dissecção de tecido, abrindo a lista de empregos, selecione Criar novo emprego e digite o ID e o nome do caso para digitar o nome do trabalho.
Vá para Espessura e selecione a espessura da seção usando a aba de seta para cima ou para baixo. Em seguida, vá para a preparação de tecidos, e selecione Parafinado, ou Desparaffinizado. Selecione Imagem de referência"Do arquivo e da imagem de importação.
Em seguida, selecione o arquivo para importar do dropdown como referência digital. Escaneie o estágio selecionando o botão "Estágio Scan" no canto inferior direito para capturar cada deslizamento de tecido amostral na primeira e quarta posição. Para a referência no palco, arraste a caixa para criar uma área retangular sobre o tecido e selecione a bolha circular sob a área retangular para capturar a imagem de referência do palco.
Copie este campo retângulo nas lâminas restantes do tecido da amostra nas posições de segunda a quarta lâmina, selecionando a opção de cópia no canto superior direito da imagem de referência. Em seguida, alinhe e redimensione conforme necessário. Para a imagem de referência digital, sobreponha a imagem na área retangular selecionada.
Em seguida, redimensione e alinhe a referência digital grosseiramente, em curso, zoom, para melhor combinar com o tamanho e a posição sobre o tecido amostral. Copie este campo retângulo nas lâminas restantes do tecido da amostra nas posições de segunda a quarta lâmina, selecionando a opção de cópia no canto superior direito da imagem de referência. Em seguida, alinhe e redimensione conforme necessário.
Selecione o botão "Digitalizar" no canto inferior direito para mover-se para a etapa de ajuste fino. Selecione a posição do primeiro estágio e o ícone da ferramenta Transformar na barra de ferramentas da mão direita, para fazer ajustes finos de alinhamento e zoom da referência para melhor corresponder à sobreposição do slide da amostra. Use a referência para amostrar barra deslizante na parte inferior da tela, toggling entre as imagens de referência e amostra.
E o recurso de zoom e zoom para ajustar e alcançar o alinhamento de cada posição de slides. Uma vez alcançada a sobreposição de amostra ideal, desenhe as designações do caminho de fresagem na porção colorida da imagem de referência mascarada, selecionando o ícone da ferramenta de seletor de cores na barra de ferramentas da mão direita. Desenhe os caminhos de fresagem para os slides de amostra selecionando o botão Obter anotações no canto inferior direito da tela.
Capture e colete a região anotada de interesse com quatro ou menos dicas de fresagem quando o caminho de fresagem é calculado. O uso da ponta de fresagem no canto superior esquerdo é calculado com base na área coberta, e o tamanho da ponta selecionado. O tamanho da ponta pode ser alterado sob a seta de ponta de fresagem, e o uso da ponta será recalculado.
Quando o caminho de fresar for selecionado na primeira posição de deslizamento, ele será copiado nas posições restantes do slide. Selecione o botão "Configuração" no canto inferior direito da tela para o carregamento imediato das pontas de fresagem dos tubos de coleta em sua designação adequada no palco. Encha o reservatório com três mililitros de tampão de dissecção apropriado para o tipo de tecido, e para extração de ácido nucleico a jusante.
Em seguida, selecione o botão Disseco"no canto inferior direito da tela. Após a dissecção automatizada, remova os tubos de coleta e os slides de amostra dissecados do estágio. Coloque os tubos de coleta no rack do tubo e os slides no rack de slides.
A formalina manchada de H&E, parafina fixa embutida e seções frescas de fígado de rato congelado contendo câncer colorretal metastático em xenoenxertos foram escaneados em um inteiro imager de slides em 20x de ampliação, e usado como slides de referência. Os slides de referência manchados de H&E foram anotados e digitalmente mascarados para regiões tumorais para dissecção e extração de ácido nucleico. Os slides amostrais pós-dissecados foram manchados por H&E para confirmar as áreas de dissecção em slides de 10 micrômetros e 20 micrômetros.
Métricas capturadas demonstraram o sucesso da dissecção automatizada e extração de ácido nucleico. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que alcançar uma sobreposição relativamente precisa de anotação sobre os slides não manchados é importante para isolar áreas de interesse.
