Nosso protocolo fornece uma maneira de estudar bactérias resistentes a antibióticos em um ambiente nutricional e físico semelhante à forma como elas provavelmente existem in vivo. Uma das maiores vantagens dessa técnica é a capacidade de capturar imagens de alta resolução e dados fenotípicos de bactérias em tamanhos populacionais relevantes para infecções. Isso é agregado de aproximadamente 10 a 1.000 células.
Demonstrando o procedimento estará Alexa Gannon, uma assistente de pesquisa de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, esterilize o meio contendo mucina sob luz ultravioleta por quatro horas. Transfira a mucina tratada por UV em tubos estéreis de 1,7 mililitros em condições estéreis e armazene os tubos a menos 20 graus Celsius.
Após a preparação da base tamponada, adicione a solução de estoque de mucina na base tamponada contendo DNA, conforme descrito no manuscrito do texto. Na noite anterior ao experimento, inocularam cinco mililitros de caldo LB com várias colônias de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 de um antibiótico contendo placa de ágar LB e cultura a bactéria durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 250 revoluções por minuto. Na manhã seguinte, pelo menos duas horas antes de iniciar o experimento, ligue o microscópio de varredura a laser confocal e abra o módulo de incubação no software de imagem associado.
Diluir 500 microliters da cultura em cinco mililitros de caldo LB fresco e incubar a suspensão bacteriana a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto durante 60 a 90 minutos. Quando as bactérias entrarem na fase de tronco, pelota as células bacterianas por centrifugação e lave as células três vezes com pbs esterilizado por filtro. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em um mililitro de PBS.
Meça a absorção da suspensão celular bacteriana em 600 nanômetros para determinar o volume de cultura necessário para uma densidade óptica de 0,05 em cinco mililitros de fibrose sintética escarro de escarro dois. Inocular o volume calculado de suspensão celular bacteriana no meio e vórtice suavemente antes de adicionar um mililitro de células a cada câmara de um prato de cultura óptica de quatro câmaras, em seguida, incubar as bactérias por quatro horas em condições estáticas a 37 graus Celsius. Para imagem os agregados pseudomonas aeruginosa pelo microscópio de varredura a laser confocal, no final da incubação, designar três poços da placa de cultura como tratamento antibiótico se replica e um bem como o controle sem tratamento e colocar a placa no palco aquecido no microscópio.
Selecione um objetivo de imersão em óleo 63X e abra a guia de localização para identificar os agregados bacterianos no campo brilhante. Defina uma área para imagem dentro de cada poço e use o módulo de posições para armazenar a posição da área. Defina o comprimento de onda de excitação para 488 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 509 nanômetros.
No módulo de aquisição, selecione a opção Z-stack para adquirir as imagens e use o módulo de média de linha para reduzir a fluorescência de fundo no canal GFP dentro do volume total das imagens de pilha Z. Defina a opção de série temporal para capturar 60 fatias em cada poço em intervalos de 15 minutos por 18 horas e use a estratégia de foco definitiva para armazenar um plano focal para cada posição que será reimagem em cada ponto de tempo durante todo o experimento. 4-1/2 horas após a configuração do experimento de imagem, imagem cada posição para determinar a biomassa agregada dentro de cada um dos quatro poços antes da adição do antibiótico.
Depois de seis horas, adicione suavemente antibiótico duas vezes abaixo da concentração inibitória mínima para o meio de cada poço basta explodir a interface líquida de ar e clicar em iniciar o experimento de início para iniciar a imagem de tratamento pós-antibiótico. Para isolar as células vivas, ao final do período de imagem de 18 horas, rotule as bactérias em cada poço com o volume adequado de iodeto de propídio de acordo com as recomendações do fabricante. No final da incubação, use um recipiente isolado para transferir a placa para o citómetro de fluxo e ajuste o cítmetro para detectar gfp e iodeto de propidium usando um bico de 70 mícrons, em seguida, execute uma alíquota mililitro de cada cultura supernante na menor taxa de fluxo para classificar o fFP-positivo e inviável propidium iodide negativo Pseudomonas aeruginosa agregados.
Para quantificar a dinâmica agregada, carregue as imagens em um programa de software de análise de imagem adequado e crie histogramas das contagens produzidas para o controle não tratado e culturas tratadas com antibióticos no canal GFP para permitir a quantificação da fluorescência de fundo. Para garantir que os voxels GFP detectados se correlacionem com a biomassa bacteriana, defina um voxel GFP positivo como maior ou igual a 1,5 vezes o valor da contagem de fundo do GFP. Produza as superfícies ISO para todos os voxels restantes e para detectar agregados individuais, habilite a opção de objetos divididos e defina os agregados como objetos.
Use o módulo de vantagem para calcular o volume XYZ e a soma dos voxels GFP para cada objeto individual. Exporte esses dados para uma plataforma estatística externa. Filtre os dados exportados por tamanho para definir objetos com volumes maiores ou iguais a cinco micrômetros cúbicos.
Remova quaisquer objetos com menos de 0,5 micrômetros cúbicos e use o módulo de vantagem para calcular a distância de cada objeto em relação a outros objetos dentro de cada imagem. Alternativamente, a distância pode ser calculada utilizando a fórmula e, em seguida, utilizar a soma e os cálculos médios para determinar a biomassa total no volume agregado médio. Embora múltiplos agregados bacterianos viáveis permaneçam após quatro horas de aplicação de antibióticos, a biomassa total das populações agregadas dentro das culturas tratadas com antibióticos é significativamente reduzida em comparação com a de culturas não tratadas.
A microscopia da série temporal pode ser usada para determinar os padrões espaciais entre agregados positivos de iodeto de propídio sensível e agregados positivos de GFP após o tratamento com antibióticos. Ao calcular como agregados de diferentes tamanhos contribuem para a população em geral, podem ser identificados padrões de como os agregados respondem ao tratamento com antibióticos em relação ao seu tamanho, forma e posição. Após o tratamento com antibióticos, agregados viáveis e inviáveis podem ser separados com sucesso de acordo com sua expressão de sinal fluorescente.
Esperamos que este protocolo inspire outros pesquisadores a estudar seu organismo de escolha em uma resolução semelhante. Nosso objetivo é encontrar fios biológicos comuns nessas comunidades complexas, independentemente do local da infecção.
