Protokolümüz, antibiyotiğe dirençli bakterileri, muhtemelen in vivo olarak var olduklarına benzer bir beslenme ve fiziksel ortamda incelememiz için bir yol sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajlarından biri, enfeksiyonla ilgili popülasyon boyutlarında bakterilerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini ve fenotipik verilerini yakalama yeteneğidir. Bu yaklaşık 10 ila 1.000 hücreden oluşan bir agrega.
Prosedürü gösteren alexa Gannon olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans araştırma asistanı. Başlamak için, dil içeren ortamı dört saat boyunca ultraviyole ışık altında sterilize edin. UV ile işlenmiş mücin steril koşullarda steril 1.7 mililitre tüplere aktarın ve tüpleri eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Tamponlu tabanı hazırladıktan sonra, metin el yazmasında açıklandığı gibi DNA içeren tamponlu tabana mucin stok çözeltisini ekleyin. Deneyden önceki akşam, LB agar plakası içeren bir antibiyotikten pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91'in birkaç kolonisi ile beş mililitre LB suyu aşıla ve bakterileri dakikada 250 devirde ajitasyonla 37 santigrat derecede bir gecede kültüre edin. Ertesi sabah, deneye başlamadan en az iki saat önce, konfokal lazer tarama mikroskobu açın ve ilişkili görüntüleme yazılımındaki inkübasyon modülunu açın.
Kültürün 500 mikrolitresini beş mililitre taze LB suyunda seyreltin ve bakteri süspansiyonu 37 santigrat derecede ve dakikada 250 devirde 60 ila 90 dakika kuluçkaya bırakın. Bakteriler kütük fazı içine girdiğinde, bakteri hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin ve filtre sterilize PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, peleti bir mililitre PBS'de yeniden ıslatır.
Beş mililitre sentetik kistik fibrozis orta ikisinde 0,05 optik yoğunluk için gereken kültür hacmini belirlemek için bakteri hücresi süspansiyonunun emiciliğini 600 nanometrede ölçün. Dört odalı bir optik kültür çanağının her odasına bir mililitre hücre eklemeden önce orta ve girdaptaki bakteri hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini hafifçe aşılayın, ardından bakterileri 37 santigrat derecede statik koşullar altında dört saat kuluçkaya yatırın. Pseudomonas aeruginosa agregalarını konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülemek için, inkübasyonun sonunda, antibiyotik tedavisi çoğalırken kültür plakasının üç kuyusunu ve bir tedavi kontrolünün olmamasını belirleyin ve plakayı mikroskoptaki ısıtmalı aşamaya yerleştirin.
Bir 63X yağ daldırma hedefi seçin ve parlak alanda bakteriyel agregaları tanımlamak için bulma sekmesini açın. Her kuyuda görüntüleme için bir alan tanımlayın ve alan konumunu depolamak için konumlar modülunu kullanın. Heyecan dalga boyunu 488 nanometreye, emisyon dalga boyunu 509 nanometreye ayarlayın.
Alma modülünde, görüntüleri elde etmek için Z yığını seçeneğini seçin ve Z yığını görüntülerinin toplam hacmi içinde GFP kanalındaki arka plan floresanını azaltmak için çizgi ortalama modülini kullanın. 18 saat boyunca her kuyuda 15 dakikalık aralıklarla 60 dilim yakalamak için zaman serisi seçeneğini ayarlayın ve deneme boyunca her zaman noktasında yeniden görüntülenecek her konum için bir odak düzlemi depolamak için kesin odak stratejisini kullanın. Görüntüleme deneyini kurduktan 4-1/2 saat sonra, antibiyotik eklenmeden önce dört kuyunun her birinde toplam biyokütleyi belirlemek için her pozisyonu görüntüleyin.
Altı saat sonra, her kuyunun ortasına minimum inhibitör konsantrasyonun iki kat altında yavaşça antibiyotik ekleyin, sadece hava sıvı arayüzünü üfleyin ve antibiyotik sonrası tedavi görüntülemeye başlamak için deneye başlayın. Canlı hücreleri izole etmek için, 18 saatlik görüntüleme süresinin sonunda, her kuyudaki bakterileri üreticinin önerilerine göre uygun miktarda propidium iyodür ile etiketleyin. Kuluçkanın sonunda, Plakayı akış sitometresine aktarmak için yalıtımlı bir kap kullanın ve 70 mikron nozul kullanarak GFP ve propidium iyodürü tespit etmek için sitometreyi ayarlayın, ardından uygulanabilir GFP pozitif ve uygun olmayan propidium iyodür negatif Pseudomonas aeruginosas agregalarını sıralamak için her kültür süpernatantının bir mililitre aliquots'ını en düşük akış hızında çalıştırın.
Toplama dinamiklerini ölçmek için görüntüleri uygun bir görüntü analizi yazılım programına yükleyin ve arka plan floresanının ölçülmesine izin vermek için GFP kanalındaki işlenmemiş kontrol ve antibiyotik tedavi edilen kültürler için üretilen sayıların histogramlarını oluşturun. Tespit edilen GFP voksellerinin bakteriyel biyokütle ile ilişkili olduğundan emin olmak için, GFP pozitif bir voksel'i GFP arka plan sayısı değerinin 1,5 katından büyük veya buna eşit olarak tanımlayın. Kalan tüm vokseller için ISO yüzeyleri üretin ve tek tek agregaları algılamak için bölünmüş nesneler seçeneğini etkinleştirin ve toplamları nesne olarak tanımlayın.
Her bir nesne için XYZ birimini ve GFP voksellerinin toplamını hesaplamak için bakış modülünü kullanın. Bu verileri harici bir istatistik platformuna verin. Beş metreküp mikrometreden büyük veya buna eşit birimlere sahip nesneleri tanımlamak için dışa aktarılan verileri boyuta göre filtreleyin.
0,5 kübik mikrometreden küçük nesneleri kaldırın ve her nesnenin her görüntüdeki diğer nesnelerle ilgili mesafesini hesaplamak için bakış modülünü kullanın. Alternatif olarak, mesafe formül kullanılarak hesaplanabilir, daha sonra ortalama toplam hacimdeki toplam biyokütleyi belirlemek için toplam ve ortalama hesaplamaları kullanabilirsiniz. Dört saatlik antibiyotik uygulamasından sonra birden fazla canlı bakteriyel agrega kalsa da, antibiyotikle tedavi edilen kültürlerdeki toplam popülasyonların toplam biyokütlesi, tedavi edilmemiş kültürlere kıyasla önemli ölçüde azalır.
Zaman serisi mikroskopisi antibiyotik tedavisinden sonra hassas propidium iyodür pozitif ve hoşgörülü GFP-pozitif agregalar arasındaki mekansal kalıpları belirlemek için kullanılabilir. Farklı boyutlardaki agregaların genel popülasyona nasıl katkıda bulunduğunu hesaplayarak, agregaların antibiyotik tedavisine boyutlarına, şekillerine ve konumlarına göre nasıl yanıt verdiklerine dair kalıplar tanımlanabilir. Antibiyotik tedavisinden sonra, canlı ve canlı olmayan agregalar floresan sinyal ifadelerine göre başarıyla ayrılabilir.
Umarız bu protokol diğer araştırmacılara da benzer bir çözünürlükte seçtikleri organizmayı incelemeleri için ilham verir. Amacımız, enfeksiyon bölgesinden bağımsız olarak bu karmaşık topluluklarda ortak biyolojik iplikler bulmaktır.
