Notre protocole nous permet d’étudier les bactéries résistantes aux antibiotiques dans un environnement nutritionnel et physique similaire à la façon dont elles existent probablement in vivo. L’un des plus grands avantages de cette technique est la capacité de capturer des images haute résolution et des données phénotypiques de bactéries dans des tailles de population pertinentes pour l’infection. C’est des agrégats d’environ 10 à 1 000 cellules.
Alexa Gannon, une assistante de recherche diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, stérilisez le milieu contenant de la mucine sous la lumière ultraviolette pendant quatre heures. Transférer la mucine traitée aux UV dans des tubes stériles de 1,7 millilitre dans des conditions stériles et stocker les tubes à moins 20 degrés Celsius.
Après avoir préparé la base tamponnée, ajoutez la solution stock de mucine dans la base tamponnée contenant de l’ADN comme décrit dans le manuscrit textuel. La veille de l’expérience, inoculez cinq millilitres de bouillon LB avec plusieurs colonies de Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 à partir d’un antibiotique contenant une plaque de gélose LB et culturez la bactérie pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une agitation à 250 tours par minute. Le lendemain matin, au moins deux heures avant le début de l’expérience, allumez le microscope à balayage laser confocal et ouvrez le module d’incubation dans le logiciel d’imagerie associé.
Diluer 500 microlitres de la culture dans cinq millilitres de bouillon LB frais et incuber la suspension bactérienne à 37 degrés Celsius et 250 tours par minute pendant 60 à 90 minutes. Lorsque les bactéries sont entrées dans la phase logarithmique, a granuler les cellules bactériennes par centrifugation et laver les cellules trois fois avec du PBS stérilisé par filtre. Après le dernier lavage, resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS.
Mesurer l’absorbance de la suspension cellulaire bactérienne à 600 nanomètres pour déterminer le volume de culture requis pour une densité optique de 0,05 dans cinq millilitres d’expectorations synthétiques de fibrose kystique milieu deux. Inoculer doucement le volume calculé de suspension de cellules bactériennes dans le milieu et le vortex avant d’ajouter un millilitre de cellules à chaque chambre d’une boîte de culture optique à quatre chambres, puis incuber les bactéries pendant quatre heures dans des conditions statiques à 37 degrés Celsius. Pour imager les agrégats de Pseudomonas aeruginosa au microscope confocal à balayage laser, à la fin de l’incubation, désignez trois puits de la plaque de culture comme réplique le traitement antibiotique et un puits comme contrôle sans traitement et placez la plaque sur la scène chauffée dans le microscope.
Sélectionnez un objectif d’immersion dans l’huile 63X et ouvrez la languette de localisation pour identifier les agrégats bactériens dans le champ lumineux. Définissez une zone d’imagerie dans chaque puits et utilisez le module positions pour stocker la position de la zone. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 488 nanomètres et la longueur d’onde d’émission à 509 nanomètres.
Dans le module d’acquisition, sélectionnez l’option Z-stack pour acquérir les images et utilisez le module de moyenne linéaire pour réduire la fluorescence d’arrière-plan dans le canal GFP dans le volume total des images Z-stack. Définissez l’option de série chronologique pour capturer 60 tranches dans chaque puits à des intervalles de 15 minutes pendant 18 heures et utilisez la stratégie de mise au point définie pour stocker un plan focal pour chaque position qui sera ré-imagé à chaque point temporel tout au long de l’expérience. 4-1/2 heures après la mise en place de l’expérience d’imagerie, imagez chaque position pour déterminer la biomasse agrégée dans chacun des quatre puits avant l’ajout de l’antibiotique.
Après six heures, ajoutez doucement un antibiotique à deux fois en dessous de la concentration minimale inhibitrice au milieu de chaque puits, soufflez simplement l’interface air liquide et cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’imagerie post-traitement antibiotique. Pour isoler les cellules vivantes, à la fin de la période d’imagerie de 18 heures, étiqueter les bactéries dans chaque puits avec le volume approprié d’iodure de propidium selon les recommandations du fabricant. À la fin de l’incubation, utilisez un récipient isolé pour transférer la plaque au cytomètre en flux et réglez le cytomètre pour détecter la GFP et l’iodure de propidium à l’aide d’une buse de 70 microns, puis exécutez un millilitre d’aliquotes de chaque surnageant de culture au débit le plus bas pour trier les agrégats viables de Pseudomonas aeruginosa négatifs à l’iodure de propidium positifs et non viables.
Pour quantifier la dynamique agrégée, chargez les images dans un logiciel d’analyse d’images approprié et créez des histogrammes des comptes produits pour les cultures témoins non traitées et traitées aux antibiotiques dans le canal GFP afin de permettre la quantification de la fluorescence de fond. Pour vous assurer que les voxels GFP détectés sont corrélés à la biomasse bactérienne, définissez un voxel GFP positif comme étant supérieur ou égal à 1,5 fois la valeur de fond du GFP. Produisez les surfaces ISO pour tous les voxels restants et pour détecter des agrégats individuels, activez l’option fractionner les objets et définissez les agrégats en tant qu’objets.
Utilisez le module vantage pour calculer le volume XYZ et la somme des voxels GFP pour chaque objet individuel. Exportez ces données vers une plateforme statistique externe. Filtrez les données exportées par taille pour définir des objets dont les volumes sont supérieurs ou égaux à cinq micromètres cubes.
Retirez tous les objets de moins de 0,5 micromètre cube et utilisez le module vantage pour calculer la distance de chaque objet par rapport aux autres objets de chaque image. Alternativement, la distance peut être calculée à l’aide de la formule, puis utiliser la somme et les calculs moyens pour déterminer la biomasse totale dans le volume agrégé moyen. Bien qu’il reste plusieurs agrégats bactériens viables après quatre heures d’application d’antibiotiques, la biomasse totale des populations agrégées dans les cultures traitées aux antibiotiques est considérablement réduite par rapport à celle des cultures non traitées.
La microscopie de séries chronologiques peut être utilisée pour déterminer les modèles spatiaux entre les agrégats sensibles à l’iodure de propidium positifs et les agrégats tolérants gFP positifs après un traitement antibiotique. En calculant comment les agrégats de différentes tailles contribuent à la population globale, il est possible d’identifier des modèles de la façon dont les agrégats répondent au traitement antibiotique en fonction de leur taille, de leur forme et de leur position. Après un traitement antibiotique, les agrégats viables et non viables peuvent être séparés avec succès en fonction de leur expression de signal fluorescent.
Nous espérons que ce protocole inspirera d’autres chercheurs à étudier l’organisme de leur choix à une résolution similaire. Notre objectif est de trouver des fil conducteurs communs dans ces communautés complexes, quel que soit le site de l’infection.
