우리의 프로토콜은 우리가 생체 내에서 존재 할 가능성이 방법과 유사한 영양 및 물리적 환경에서 항생제 내성 박테리아를 연구 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 가장 큰 장점 중 하나는 감염 관련 인구 규모에서 박테리아의 고해상도 이미지와 현상 전도 데이터를 캡처할 수 있는 기능입니다. 이는 약 10~1, 000개의 셀의 집합체입니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원 연구 조교 인 알렉사 Gannon이 될 것입니다. 시작하려면, 4 시간 동안 자외선 아래 mucin 함유 배지를 살균. UV 처리된 뮤신을 멸균 조건하에서 멸균 1.7 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 영하 20도에 보관합니다.
완충된 베이스를 준비한 후, 문헌에 설명된 바와 같이 DNA를 포함하는 완충된 베이스에 뮤신의 스톡 용액을 추가한다. 실험 전날 저녁에는 LB 한천판을 함유한 항생제로부터 슈도모나스 아에루기노사 PAO1 pMRP91의 여러 식민지를 가진 LB 국물의 5밀리리터를 접종하고 분당 250개의 회전으로 37도의 섭씨에서 하룻밤 사이에 박테리아를 배양한다. 다음 아침, 실험을 시작하기 전에 적어도 2 시간, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 켜고 관련 이미징 소프트웨어에서 인큐베이션 모듈을 엽니다.
500 마이크로리터를 신선한 LB 국물 5밀리리터로 희석하고 세균 현탁액을 섭씨 37도, 분당 250회전에서 60~90분 동안 배양합니다. 박테리아가 로그 단계에 들어갔을 때, 원심분리에 의해 세균 세포를 펠릿하고 필터 살균 PBS로 세포를 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, PBS의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.
합성 낭포성 섬유증 가래 배지 2의 5 밀리리터에서 0.05의 광학 밀도에 필요한 배양 부피를 결정하기 위해 600 나노미터에서 세균 세포 현탁액의 흡광도를 측정한다. 4 챔버 광학 배양 접시의 각 챔버에 세포의 1 밀리리터를 추가하기 전에 중간 및 소용돌이에서 세균 세포 현탁액의 계산 된 볼륨을 부드럽게 접종 한 다음 37 섭씨37도에서 정적 조건하에서 4 시간 동안 박테리아를 배양합니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 의한 슈도모나스 아에루기노사 골재를 이미지하기 위해, 배양판의 3개의 우물을 항생제 치료가 복제하고 하나뿐만 아니라 치료 제어가 없는 것으로 지정하고 현미경의 가열된 단계에 플레이트를 배치한다.
63X 오일 침지 목표를 선택하고 찾기 탭을 열어 브라이트필드에서 세균 성 골재를 식별합니다. 각 웰 내에서 이미징 영역을 정의하고 위치 모듈을 사용하여 영역 위치를 저장합니다. 488 나노미터로 발산 파장을 설정하고 방출 파장을 509 나노미터로 설정합니다.
획득 모듈에서 Z 스택 옵션을 선택하여 이미지를 획득하고 라인 평균 모듈을 사용하여 Z 스택 이미지의 총 부피 내에서 GFP 채널의 배경 형광을 줄입니다. 타임 시리즈 옵션을 설정하여 각 웰의 60개의 슬라이스를 18시간 동안 15분 간격으로 캡처하고 명확한 초점 전략을 사용하여 실험 전반에 걸쳐 각 시점에 다시 이미지화될 각 위치에 대해 초점 평면을 저장합니다. 이미징 실험을 설정한 후 4-1/2시간, 각 위치를 이미지하여 항생제를 첨가하기 전에 4개의 우물 내의 골재 바이오매스를 결정한다.
6시간 후, 항생제를 각각의 중간까지 최소 억제 농도보다 2배 낮으로 부드럽게 첨가하면 공기액 인터페이스를 날려 버리고 시작 실험을 클릭하여 항생제 후 치료 영상을 시작한다. 살아있는 세포를 격리하기 위해, 18 시간 화상 진찰 기간의 끝에, 제조 업체의 권고에 따라 프로피듐 요오드의 적당한 양으로 각 우물에 있는 박테리아를 레이블. 인큐베이션의 끝에서, 절연 용기를 사용하여 플레이트를 유동 세포계로 옮기고 사이토미터를 설정하여 70 미크로네 노즐을 사용하여 GFP 및 프로피듐 요오드를 감지한 다음, 가능한 GFP 양성 및 비실행성 오퍼디드 디오디온 을 분류하기 위해 각 배양 체형의 1밀리리터 알리쿼시를 가장 낮은 유량으로 실행한다.
골역학을 정량화하기 위해 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 로드하고 GFP 채널에서 치료되지 않은 제어 및 항생제 처리 배양을 위해 생성된 카운트의 히스토그램을 만들어 배경 형광의 정량화를 허용한다. 검출된 GFP 복셀이 세균 바이오매스와 상관관계가 있는지 확인하기 위해 GFP 양성 복셀을 GFP 백그라운드 수 값의 1.5배 이상으로 정의합니다. 남은 모든 복셀에 대해 ISO 서피스를 생성하고 개별 집계를 감지하고 분할 객체 옵션을 활성화하고 집계를 개체로 정의합니다.
유리한 모듈을 사용하여 각 개별 개체에 대한 볼륨 XYZ 및 GFP 복셀 합계를 계산합니다. 이 데이터를 외부 통계 플랫폼으로 내보냅니다. 내보낸 데이터를 크기별로 필터링하여 5입방 마이크로미터보다 크거나 동일한 볼륨을 가진 객체를 정의합니다.
0.5입방마이크로미터 미만의 객체를 제거하고 유리한 모듈을 사용하여 각 이미지 내의 다른 개체와 관련하여 각 개체의 거리를 계산합니다. 또는, 거리는 수식을 사용하여 계산할 수 있고, 합계 및 평균 계산을 사용하여 평균 집계 부피의 총 바이오매스를 결정할 수 있다. 여러 개의 가능한 세균성 골재가 항생제 적용 후에 남아 있더라도, 항생제 처리한 배양 내의 총 집단의 총 바이오매스는 처리되지 않은 배양에 비해 현저하게 감소됩니다.
타임시리즈 현미경검사는 항생제 치료 후 민감한 요오드 양성 및 내성 GFP 양성 골집 사이의 공간 패턴을 결정하는 데 사용될 수 있다. 다양한 크기의 골재가 전체 인구에 기여하는 방법을 계산함으로써, 골재가 그들의 크기, 모양 및 위치와 관련하여 항생제 치료에 어떻게 반응하는지의 패턴을 확인할 수 있습니다. 항생제 치료 후, 실행 가능한 및 비 실행 가능한 골재는 형광 신호 발현에 따라 성공적으로 분리 될 수 있습니다.
우리는 이 프로토콜이 다른 연구자들이 비슷한 해상도로 선택의 유기체를 연구하도록 영감을 주기를 바랍니다. 우리의 목표는 감염 부위에 관계없이 이러한 복잡한 지역 사회에서 일반적인 생물학적 실을 찾는 것입니다.
