פרוטוקול זה משמש כדי ללמוד את איכויות התחבורה של צמתים הדוקים. באמצעות פוטנציאל דילול, אתה יכול למדוד את permselectivity ולקבל הבנה של צמתים הדוקים ברקמה. טכניקה זו היא ספציפית ומשתמשת ברקמות מקומיות למחקרים פונקציונליים של אפיתליה.
בנוסף, טכניקה זו מודדת את התכונות הפיזיולוגיות בזמן אמת של רקמה, וזה מאוד שימושי. האתגר הגדול ביותר הוא הכנת רקמות. תרגול הטכניקה, כמו גם צפייה בסרטון זה יעזור.
כדי לאשר את הכדאיות של הרקמה הוא גם צעד חשוב. כדי להתחיל, למקם את המקטעים הרצויים של רקמת מעיים שנאספו מעכברי נוקאאוט קלודין-15 לתוך פתרון בועות בועות קרות כקרח ולחתוך את השומן ואת רקמת החיבור. לאחר חיתוך השומן ורקמת החיבור, לחתוך לאורך קבצים מצורפים מזנטריים כדי לפתוח כל קטע לאורך, ולאחר מכן להחזיר את המקטעים לפתרון של רינגר קר כקרח ולשטוף את החלקים ביסודיות.
כדי להפשיט את שכבת השרירים, יוצקים שניים עד שלושה מיליליטרים של קר כקרח טרי בועות פתרון של רינגר לתוך צלחת חיתוך מצופה גומי סיליקון תחת מיקרוסקופ ביתור ולהשתמש בסיכות כדי להבטיח את הקצוות של קטע רקמת מעיים אחד בצלחת עם הצד הרירית פונה כלפי מטה. באמצעות מלקחיים עדינים, לנתח בבוטות את שכבת השריר מן הרירית הבסיסית, להיזהר לא לקרוע או להכניס כל חורים לתוך הרקמה. לאחר ששכבת השריר הוסרה, חותכים חתיכה גדולה מספיק לפתיחה בקוטר חמישה מילימטר ומניחים את הרקמה על פיסת נייר סינון מנוקבת חמישה מילימטר רטובה עם הצד הרירי של הפתרון של רינגר כלפי מטה באמצעות רקע שחור כדי להבטיח כי הפתח בנייר המסנן מכוסה לחלוטין על ידי הרקמה ללא קמטים.
כדי להרכיב את ההכנות במעיים בתא ברית המועצות, תחילה להסיר כל פתרון מהתא לפני הפצתו. הנח את נייר הסינון עם הצד הרירית של הכנת המעיים כלפי מטה על תא הצד הרירית באמצעות הסימנים השחורים כדי ליישר את חלון התא עם החור בנייר המסנן. בזהירות לחבר את התא בצד השחוק לתא הצד הרירית מבלי להזיז את גיליון המעיים.
מלאו במהירות את שני התאים במאגר HEPES והניחו את החדרים המבעבעים בקצה הנגדי של כל תא הרחק מהקרום. חבר מחדש את גשרי המלח ובדוק אם המתח יציב, ולאחר מכן דופק את הזרם כדי להבטיח שהחיבורים בסדר לפני שתאפשר למערכת להשתוות במשך כ -15 דקות. כדי לבצע ניסוי פוטנציאלי דילול, ראשית לשטוף את שני הצדדים של התא עם חמישה מיליליטרים של חיץ HEPES טרי לפני מחומם לכל צד.
הפעל את מערכת ההקלטה והגדר את הטווח ל-250 מיליוולט. הגדר את עמדות הסמן, הגדר את מערכת ההקלטה למדוד והגדר את מערכות תא ברית המועצות למצב הידוק. לאחר שפוטנציאל המדידה התייצב, השתמש בנתונים למדידות.
החלף במהירות את חיץ HEPES מהצד הרירי של התא עם חמישה מיליליטרים של חיץ HEPES דילול מחומם בתוספת 75 מילימטר נתרן כלורי. לאחר פוטנציאל הממברנה הגיע לשיאו, להחליף את מאגר דילול מן הצד הרירית עם חיץ HEPES טרי. כדי להבטיח כי הרקמה היא בת קיימא, להוסיף 10 micromolar Forskolin לצד הסחף.
ברגע שההבדל הפוטנציאלי של הממברנה הגיע לשיא ומתחיל לרדת, הניסוי נגמר. כדי למדוד את ההולכה החשמלית הטרנס-אפיתלית ואת זרם הקצר הבסיסי, לאחר שטיפת שני צידי התא כפי שהוכח, הוסף חמישה מיליליטר של פתרון רינגר מבעבע טרי לכל צד והגדר את טווח מערכת ההקלטה ל-2.5 וולט. הגדר את עמדות הסמן, הגדר את מערכת ההקלטה למדידת מערכת ההקלטה והגדר את מערכת תאי ברית המועצות למצב הידוק.
לאחר שזרם המעגל הקצר וההולכה התייצבו, השתמש בנתונים למדידות בסיסיות. כדי להבטיח כי הרקמה היא בת קיימא, להוסיף Forskolin לצד הסחף כפי שהוכח. ברגע שההבדל הפוטנציאלי של הממברנה הגיע לשיאו והחל לרדת, הניסוי הסתיים.
בניתוח מייצג זה, ההולכה הטרנס-מולקולרית הבסיסית של מקטע המעי הקטן האמצעי הייתה נמוכה יותר בעכברים בנוקאאוט קלודין-15 בתנאי קצר בהשוואה לזו שנצפתה בעכברים מסוג בר, בעוד שזרם הקצר הבסיסי היה גבוה יותר. עם דילול נתרן כלורי זוהר, הבדל פוטנציאלי חיובי ביחס לצד הסחוסאלי נצפה בעכברים מסוג פראי, אך ההבדל הופחת בעכברים בנוקאאוט קלודין-15. באופן דומה, החדירות היחסית של נתרן כלורי ירדה גם בחיות הנוקאאוט.
חישוב החדירות המוחלטת גילה כי החדירות המוחלטת של נתרן ירדה בעכברים בנוקאאוט קלודין-15, בעוד החדירות המוחלטת של כלוריד לא, דבר המצביע על כך שהירידה בחדירות היחסית נובעת מירידה בחדירות הנתרן. כצפוי, תוספת של Forskolin לצד הסחף של התא לא גרם הבדל משמעותי בשינוי של זרם קצר בין נוקאאוט ועכברים מסוג בר. מאז מקטעי המעיים הפגינו תגובה גדולה מספיק Forskolin, ההכנות הממברנה נחשבו קיימא.
חשוב לבצע הסרת שכבת שריר מתאימה וכדי להבטיח כי הרקמה היא בת קיימא. נא לשטוף את החלק הנתיחה של העכברים אם ההכנה היא בת קיימא.
