Этот протокол используется для изучения транспортных качеств плотных соединений. Используя потенциалы разбавления, вы можете измерить пермселективность и получить представление о плотных соединениях в ткани. Эта методика специфична и использует нативные ткани для функциональных исследований эпителия.
Кроме того, этот метод измеряет физиологические свойства ткани в режиме реального времени, что очень полезно. Самой большой проблемой является подготовка тканей. Поможет отработка техники, а также просмотр этого видео.
подтверждение жизнеспособности тканей также является важным шагом. Для начала поместите нужные сегменты кишечной ткани, собранные у нокаутирующих мышей claudin-15, в ледяной пузырьковый раствор Рингера и обрежьте жировую и соединительную ткань. После обрезки жира и соединительной ткани разрежьте вдоль брыжеечных насадок, чтобы открыть каждый сегмент продольно, затем верните сегменты в ледяной холодный раствор Рингера и тщательно вымойте кусочки.
Чтобы очистить мышечный слой, налейте два-три миллилитра свежего ледяного холодного пузырькового раствора Рингера в покрытую силиконом резину расслоительную пластину под рассеченным микроскопом и используйте штифты для закрепления концов одного сегмента кишечной ткани в чашке стороной слизистой стороны вниз. Используя тонкие щипцы, тупо рассекают мышечный слой от подлежащей слизистой оболочки, стараясь не порвать и не ввести какие-либо отверстия в ткани. После того, как мышечный слой был удален, вырежьте кусок, достаточно большой для отверстия диаметром пять миллиметров, и поместите ткань на кусок пятимиллиметровой перфорированной фильтровальной бумаги, влажной слизистой раствором Рингера, стороной вниз, используя черный фон, чтобы убедиться, что отверстие в фильтровальной бумаге полностью покрыто тканью без морщин.
Чтобы установить кишечные препараты в камеру Ussing, сначала удалите любой раствор из камеры, прежде чем разбирать его. Уложите фильтровальную бумагу слизистой оболочкой кишечного препарата стороной вниз на боковую камеру слизистой оболочки, используя черную маркировку, чтобы выровнять окно камеры с отверстием в фильтровальной бумаге. Осторожно соедините серозную боковую камеру с боковой камерой слизистой, не перемещая лист кишечника.
Быстро заполняйте обе камеры буфером HEPES и размещайте пузырьковые камеры на противоположном конце каждой камеры подальше от мембраны. Снова подключите солевые мостики и проверьте, стабильно ли напряжение, затем импульсите ток, чтобы убедиться, что соединения в порядке, прежде чем позволить системе уравновеситься в течение примерно 15 минут. Чтобы выполнить эксперимент с потенциалом разбавления, сначала промыть обе стороны камеры пятью миллилитрами свежего предварительно нагретого буфера HEPES на каждую сторону.
Включите систему записи и установите диапазон на 250 милливольт. Установите положение маркера, установите систему записи для измерения и установите системы камер Ussing в режим зажима. Как только измерительный потенциал стабилизируется, используйте данные для измерений.
Быстро замените буфер HEPES со слизистой стороны камеры пятью миллилитрами разогретого разбавляющего буфера HEPES, дополненного 75 миллимолярным хлоридом натрия. Как только мембранный потенциал достигнет пика, замените буфер разбавления со стороны слизистой оболочки свежим буфером HEPES. Чтобы убедиться, что ткань жизнеспособна, добавьте 10 микромоляров Forskolin к серозальной стороне.
Как только разность мембранных потенциалов достигла пика и начала снижаться, эксперимент заканчивается. Чтобы измерить трансэпителиальную электрическую проводимость и базовый ток короткого замыкания, после промывки обеих сторон камеры, как показано, добавьте пять миллилитров свежего пузырькового раствора Рингера с каждой стороны и установите диапазон системы записи на 2,5 вольта. Установите положение маркера, установите систему записи для измерения и установите систему камеры Ussing в режим зажима.
Как только ток короткого замыкания и проводимость стабилизируются, используйте данные для базовых измерений. Чтобы убедиться, что ткань жизнеспособна, добавьте Форсколин к серозальной стороне, как показано на рисунке. Как только разность мембранных потенциалов достигла пика и начала снижаться, эксперимент заканчивается.
В этом репрезентативном анализе базовая трансмукозальная проводимость среднего сегмента тонкой кишки была ниже у нокаутирующих мышей claudin-15 в условиях короткого замыкания по сравнению с тем, что наблюдалось у мышей дикого типа, в то время как базовый ток короткого замыкания был выше. При люминальном разбавлении хлорида натрия у мышей дикого типа наблюдалась положительная разность потенциалов по отношению к серозальной стороне, но разница уменьшалась у нокаутирующих мышей с клаудином-15. Аналогичным образом, относительная проницаемость хлорида натрия также была снижена у нокаутирующих животных.
Расчет абсолютной проницаемости показал, что абсолютная проницаемость натрия снижалась у нокаутирующих мышей клаудина-15, в то время как абсолютная проницаемость хлорида не снижалась, что позволяет предположить, что снижение относительной проницаемости обусловлено уменьшением проницаемости натрия. Как и ожидалось, добавление Форсколина к серозной стороне камеры не вызвало существенной разницы в изменении тока короткого замыкания между нокаутом и мышами дикого типа. Поскольку сегменты кишечника продемонстрировали достаточно большую реакцию на Форсколин, мембранные препараты считались жизнеспособными.
Важно выполнить соответствующее удаление мышечного слоя и убедиться, что ткань жизнеспособна. Пожалуйста, промойте секцию рассечения мышей, является ли препарат жизнеспособным.
