このプロトコルは、タイトジャンクションの輸送品質を研究するために使用されます。希釈電位を使用すると、透過選択性を測定し、組織内のタイトジャンクションを理解することができます。この技術は特異的であり、上皮の機能的研究のために天然組織を使用する。
さらに、この技術は、組織のリアルタイムの生理学的特性を測定し、これは非常に有用である。最大の課題は組織の準備です。テクニックを練習し、このビデオを見ることが役立ちます。
組織生存率を確認することも重要なステップである。まず、クローディン-15ノックアウトマウスから採取した腸組織の所望のセグメントを氷冷気泡リンゲル溶液に入れ、脂肪および結合組織をトリミングする。脂肪と結合組織をトリミングした後、腸間膜アタッチメントに沿って切断して各セグメントを縦方向に開き、セグメントを氷冷リンガー溶液に戻し、断片を徹底的に洗浄します。
筋肉層を剥がすには、解剖顕微鏡下で2〜3ミリリットルの新鮮な氷コールドバブルリンガー溶液をシリコーンゴムで覆われた解剖プレートに注ぎ、ピンを使用して粘膜側を下に向けて皿の1つの腸組織セグメントの端部を固定する。細かい鉗子を使用して、下の粘膜から筋肉層を鈍く解剖し、組織に穴を開けたり穴をあけたりしないように注意してください。筋肉層が取り除かれたら、直径5ミリメートルの開口部に十分な大きさの断片を切断し、リンゲル溶液粘膜側で濡れた5ミリメートルのパンチされたろ紙の上に組織を黒い背景を使用して置き、ろ紙の開口部がしわのない組織によって完全に覆われるようにする。
腸管製剤をUssingチャンバーに取り付けるには、まずチャンバーから溶液を取り出してから解体します。黒いマーキングを使用して、腸管製剤の粘膜側を下にしたろ紙を粘膜側チャンバーに敷き、チャンバーウィンドウをろ紙の穴に合わせます。腸管シートを動かさずに漿膜側室を粘膜側室に慎重に接続する。
両方のチャンバーにHEPESバッファーをすばやく補充し、バブリングしたものを膜から離れた各チャンバーの反対側の端に配置します。ソルトブリッジを再接続し、電圧が安定しているかどうかを確認し、電流をパルスして接続が正常であることを確認してから、システムを約15分間平衡化させます。希釈電位実験を行うために、まずチャンバーの両側を片面あたり5ミリリットルの新鮮な予め加温されたHEPES緩衝液で洗浄する。
記録システムの電源を入れ、範囲を 250 ミリボルトに設定します。マーカーの位置を設定し、記録システムを測定し、Ussingチャンバーシステムをクランプモードに設定します。測定ポテンシャルが安定したら、そのデータを測定に使用します。
チャンバーの粘膜側からHEPES緩衝液を、75ミリモルの塩化ナトリウムを添加した5ミリリットルの加温希釈HEPES緩衝液で迅速に交換する。膜電位がピークに達したら、粘膜側からの希釈緩衝液を新鮮なHEPES緩衝液に交換する。組織が生存可能であることを確認するために, 加 10 マイクロモルフォルスコリン 血清側に.
膜電位差がピークに達し、減少し始めたら、実験は終了します。経上皮電気コンダクタンスおよびベースライン短絡電流を測定するために、実証したようにチャンバーの両側を洗浄した後、5ミリリットルの新鮮な泡状リンゲル溶液を両側に加え、記録システムの範囲を2.5ボルトに設定した。マーカーの位置を設定し、測定する記録システムを設定し、Ussingチャンバーシステムをクランプモードに設定します。
短絡電流とコンダクタンスが安定したら、ベースライン測定にデータを使用します。組織が実行可能であることを確認するために, 実証されているように、漿液性側にフォルスコリンを追加します。.膜電位差がピークに達し、減少し始めたら、実験は終了します。
この代表的な解析では、中小腸セグメントのベースライン経粘膜コンダクタンスは、短絡条件下でのクローディン-15ノックアウトマウスでは野生型マウスで観察されたものと比較して低く、ベースライン短絡電流は高かった。管腔内塩化ナトリウム希釈に際し、野生型マウスでは漿膜側に対して正の電位差が認められたが、クローディン-15ノックアウトマウスではその差は減少した。同様に、塩化ナトリウムの比透磁率もノックアウト動物において低下した。
絶対透過性の計算により、クローディン-15ノックアウトマウスではナトリウムの絶対透過性が低下したが、塩化物の絶対透過性は低下しなかったことが明らかになり、比透磁率の低下はナトリウムの透過性の低下によるものであることが示唆された。予想通り、チャンバーの漿膜側へのフォルスコリンの添加は、ノックアウト型マウスと野生型マウスとの間の短絡電流の変化に有意差を引き起こさなかった。腸管セグメントはフォルスコリンに対して十分に大きな応答を示したので、膜調製物は実行可能であると考えられた。
適切な筋肉層の除去を行い、組織が生存可能であることを確認することが重要です。調製物が生存可能であるかどうかマウスの解剖部をすすいでください。
