Bu protokol, dar kavşakların taşıma özelliklerini incelemek için kullanılır. Seyreltme potansiyellerini kullanarak, geçirgen seçiciliği ölçebilir ve bir dokudaki sıkı kavşakları anlayabilirsiniz. Bu teknik spesifiktir ve epitelin fonksiyonel çalışmaları için doğal dokuları kullanır.
Ek olarak, bu teknik bir dokunun gerçek zamanlı fizyolojik özelliklerini ölçer ve bu da çok yararlıdır. En büyük zorluk doku hazırlığıdır. Tekniği uygulamak ve bu videoyu izlemek yardımcı olacaktır.
doku canlılığını doğrulamak da önemli bir adımdır. Başlamak için, claudin-15 nakavt farelerinden toplanan bağırsak dokusunun istenen bölümlerini buz gibi soğuk kabarcıklı Ringer'ın çözeltisine yerleştirin ve yağ ve bağ dokusunu kesin. Yağ ve bağ dokusunu kestikten sonra, her bir segmenti uzunlamasına açmak için mezenterik ataşmanlar boyunca kesin, ardından segmentleri buz gibi soğuk Ringer çözeltisine geri döndürün ve parçaları iyice yıkayın.
Kas tabakasını sıyırmak için, iki ila üç mililitre taze buz gibi soğuk kabarcıklı Ringer'ın çözeltisini bir diseksiyon mikroskobu altında silikon kauçuk kaplı bir diseksiyon plakasına dökün ve çanaktaki bir bağırsak dokusu segmentinin uçlarını mukozal tarafı aşağıya bakacak şekilde sabitlemek için pimleri kullanın. İnce forseps kullanarak, kas tabakasını altta yatan mukozadan açıkça diseke edin, dokuya herhangi bir delik açmamaya veya yırtmamaya dikkat edin. Kas tabakası çıkarıldıktan sonra, beş milimetre çapında bir açıklık için yeterince büyük bir parça kesin ve filtre kağıdındaki açıklığın kırışıklıklar olmadan doku tarafından tamamen kaplandığından emin olmak için siyah bir arka plan kullanarak dokuyu Ringer'ın çözelti mukozal tarafı aşağı doğru ıslatılmış beş milimetre delikli bir filtre kağıdı parçasına yerleştirin.
Bağırsak preparatlarını bir Ussing odasına monte etmek için, önce herhangi bir çözeltiyi sökmeden önce odadan çıkarın. Filtre kağıdını, bağırsak hazırlama mukozalı tarafı aşağı bakacak şekilde, oda penceresini filtre kağıdındaki delikle hizalamak için siyah işaretleri kullanarak mukozal yan odaya yerleştirin. Serozal yan odacığı, bağırsak tabakasını hareket ettirmeden mukozal yan odaya dikkatlice bağlayın.
Her iki odayı da HEPES tamponu ile hızlı bir şekilde doldurun ve köpüren odacıkları membrandan uzağa her odanın karşı ucuna yerleştirin. Tuz köprülerini yeniden bağlayın ve voltajın sabit olup olmadığını kontrol edin, ardından sistemin yaklaşık 15 dakika boyunca dengelenmesine izin vermeden önce bağlantıların iyi olduğundan emin olmak için akımı eğin. Bir seyreltme potansiyeli deneyi gerçekleştirmek için, önce odanın her iki tarafını da her iki taraf için beş mililitre taze önceden ısıtılmış HEPES tamponu ile yıkayın.
Kayıt sistemini açın ve aralığı 250 milivolta ayarlayın. İşaretçi konumlarını ayarlayın, kayıt sistemini ölçecek şekilde ayarlayın ve Ussing oda sistemlerini kelepçeleme moduna ayarlayın. Ölçüm potansiyeli stabilize edildikten sonra, verileri ölçümler için kullanın.
HEPES tamponunu, odanın mukozal tarafından, 75 milimolar sodyum klorür ile desteklenmiş beş mililitre ısıtılmış seyreltme HEPES tamponu ile hızlı bir şekilde değiştirin. Membran potansiyeli zirveye ulaştığında, mukozal taraftaki seyreltme tamponunu taze HEPES tamponu ile değiştirin. Dokunun canlı olmasını sağlamak için, serozal tarafa 10 mikromolar Forskolin ekleyin.
Membran potansiyel farkı zirveye ulaştığında ve azalmaya başladığında, deney sona erer. Transepitelyal elektriksel iletkenliği ve temel kısa devre akımını ölçmek için, gösterildiği gibi odanın her iki tarafını da yıkadıktan sonra, her iki tarafa beş mililitre taze kabarcıklı Ringer çözeltisi ekleyin ve kayıt sisteminin aralığını 2,5 volta ayarlayın. İşaretçi konumlarını ayarlayın, kayıt sistemini ölçecek şekilde ayarlayın ve Ussing oda sistemini kelepçeleme moduna ayarlayın.
Kısa devre akımı ve iletkenliği stabilize edildikten sonra, verileri taban çizgisi ölçümleri için kullanın. Dokunun canlı olmasını sağlamak için, gösterildiği gibi serosal tarafa Forskolin ekleyin. Membran potansiyel farkı zirveye ulaştığında ve azalmaya başladığında, deney sona erer.
Bu temsili analizde, orta ince bağırsak segmentinin temel transmukozal iletkenliği, kısa devre koşulları altında claudin-15 nakavt farelerinde vahşi tip farelerde gözlenenlere kıyasla daha düşükken, temel kısa devre akımı daha yüksekti. Luminal sodyum klorür seyreltmesi üzerine, vahşi tip farelerde serozal tarafa göre pozitif bir potansiyel fark gözlendi, ancak claudin-15 nakavt farelerde fark azaldı. Benzer şekilde, nakavt hayvanlarda sodyum klorürün göreceli geçirgenliği de azalmıştır.
Mutlak geçirgenliklerin hesaplanması, sodyumun mutlak geçirgenliğinin claudin-15 nakavt farelerinde azaldığını, klorürün mutlak geçirgenliğinin ise azalmadığını, göreceli geçirgenlikteki azalmanın sodyumun geçirgenliğindeki bir azalmadan kaynaklandığını ortaya koymuştur. Beklendiği gibi, Forskolin'in odanın serozal tarafına eklenmesi, nakavt ve vahşi tip fareler arasındaki kısa devre akımının değişiminde önemli bir farka neden olmamıştır. Bağırsak segmentleri Forskolin'e yeterince büyük bir yanıt gösterdiğinden, membran preparatlarının uygulanabilir olduğu düşünülmüştür.
Uygun kas tabakası çıkarma işlemini gerçekleştirmek ve dokunun canlı olmasını sağlamak önemlidir. Lütfen preparatın uygun olup olmadığını farelerin diseksiyon bölümünü durulayın.
