למיטב ידיעתנו, זוהי הדוגמה הראשונה לפרוטוקול מולטיפלקסינג מבוסס חרוזים המשתמש בשני אותות עיתונאים כדי למדוד בו זמנית שתי תוצאות לכל ניתוח. טכניקה זו מאפשרת למשתמש למדוד IgM ו- IgG ספציפיים אנטיגן בו זמנית, עם פחות מדגם וזמן קצר יותר לתוצאות. בעוד ששיטת כתב כפולה זו היא ספציפית לאיזוטיפינג נוגדנים, ניתן להתאים אותה למדידת זוגות ניתוח אחרים, כגון שינויים לאחר תרגום או צורות סמים חופשיות לעומת קשורות.
מדגים את ההליך שלנו היום יש לנו ד"ר סטיב אנג'לוני, מדען יישום שדה בכיר עבור תאגיד Luminex. כדי להתחיל את הכתב הכפול IgG ו IgM סרולוגית, להכין את תערובות חרוז מולטיפלקס הנדרש מן זוג בודדים חרוזים ולשלוט במניות חרוזים בריכוז של פעם אחת פעמים 10 עד שש חרוזים למיליליטר. לאחר מכן, לדלל את דגימות הסרום פי 100 על ידי הוספת 10 microliters של סרום ל 990 microliters של חוצץ PBS-TBN, ולאחר מכן לדלל את הדגימות עוד פי עשרה על ידי הוספת 20 microliters של 1:100 דילול ל 180 microliters של PBS-TBN.
כאשר תערובות החרוזים ודגימות הסרום מוכנות, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובות חרוזים מולטיפלקס לבארות שהוקצו של צלחת מיקרוטיטר 96-well לא מחייבת, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של דגימות הסרום המדוללות לבארות המתאימות. לאחר שכל הדגימות נוספו, מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטיק ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להפריד את החרוזים מתערובת התגובה על ידי הצבת הצלחת על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות.
שומרים את הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף. לאחר מכן הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת ולהעיף בעדינות את supernatant מתוך בארות. בעודם מחזיקים את הצלחת על המגנט, מכתימים את הצלחת על נייר סופג.
כדי לשטוף את בארות התגובה, להסיר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 microliters של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ודגרה על השייקר המחומם במשך שתי דקות לפני שמניחים אותו בחזרה על מגנט הצלחת למשך שתי דקות נוספות. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, הפוך את הצלחת כדי להשליך את supernatant, ולהכתים את הצלחת על נייר סופג.
לאחר שטיפת PBS-TBN השנייה, הסירו את הצלחת מהמגנט והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת ריאגנט לזיהוי טרי לכל באר. לאחר כיסוי הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטיק, מניחים אותו על שייקר צלחת מחומם במשך 15 דקות, ולאחר מכן על מפריד צלחת מגנטית במשך שתי דקות. בזמן שהצלחת על המגנט, יש להשליך את תערובת ריאגנט הזיהוי על ידי היפוך הצלחת מעל מיכל פסולת והשלכתה על נייר סופג.
לשטוף את בארות התגובה עם PBS-TBN פעמיים כפי שהדגים בעבר, ולאחר מכן להסיר את הצלחת מן המגנט. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של PBS-TBN לכל באר, ואז מכסים את הצלחת עם חותם רדיד אלומיניום ומנערים במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את חותם רדיד הכסף ולהמשיך לקרוא 50 microliters של המדגם מכל באר מנתח הזרימה.
כדי לקרוא את הצלחת, בחר את התפריט הנפתח בפינה הימנית העליונה, נווט לתצורת לוחית, טען את הצלחת שתצורתה נקבעה קודם לכן ובחר הפעל לוח. פלט את מנשא הלוח על-ידי בחירת סמל הוצאת, ולאחר מכן טען את הצלחת על נושא הלוח ובחר בסמל 'בטל' כדי לבטל את מנשא הלוח. לאחר שמנשא הלוחות התמשך לתוך המנתח, בחר את סמל ההפעלה כדי להתחיל לקרוא את הלוח.
לבדיקת נטרול הכתב הכפול, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תערובות החרוזים המולטיפלקסיות לבארות שהוקצו של צלחת מיקרו-טייטר לא-מחייבת של 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של שני מיקרוגרם למיליליטר ACE2 לכל באר, וכיסו את הצלחת באטם רדיד אלומיניום. לאחר דגירה של שתי דקות על שייקר צלחת מחומם, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של דילול סרום 1:500 לבארות שהוקצו. לאחר שכל הדגימות נוספו, בצע את שלבי הדגירה, הכביסה, הזיהוי והניתוח כפי שהודגם בעבר לבדיקה הסרולוגית.
בדיקה של אנטי-IgM מצומדת לצבע הכתב DyLight 405 באמצעות דגימות סרום תוך חמישה עד 60 יום מהתגלות הסימפטומים ודגימת סרום רצועת IgG לא הניב אות גבוה עבור אנטיגן ספייק. עבור דגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות בינונית IgM גבוהה, האותות הגבוהים ביותר נראו עבור תחום מחייב הקולטן אנטיגנים nucleocapsid. בעוד titer IgM היה צריך להיות גבוה בדגימות מסוימות, רמות עוצמת פלואורסצנטיות בינונית שנצפתה לא יעלה על 140 יחידות MFI.
יתר על כן, חרוז השליטה עבור IgM היה חסר טווח דינמי משמעותי לעוצמת פלואורסצנטיות חציונית בעת שימוש DyLight 405 מצומד אנטי-IgM לעומת phycoerythrin שכותרתו אנטי-IgM באותו ריכוז. עבור זיהוי IgG, מצומד סגול מבריק היה אותות עוצמת פלואורסצנטיות חציונית גבוהה יותר מאשר מצומד סטרפטאבידין של פלואורפור סופר בהיר 436. עם זאת, עוצמת האות עבור ההמולה הסגולה המבריקה השתנתה על פני טיטריציות ACE2.
תנודות אות זה על ידי מצומד סגול מבריק על פני ריכוזי ACE2 גם הפריע בקביעת עיכוב אחוז על ידי ACE2 על פני הטווח של titers IgG. עבור זיהוי IgM, phycoerythrin אנטי-IgM הציג אותות גבוהים יותר מאלה שנוצרו על ידי DyLight 549 אנטי-אנושי IgM. בעת קביעת עיכוב ACE2 אחוז של כריכת IgM, היה הבדל קל אך חסר משמעות בין שני ריאגנטים גילוי IgM.
אז אחד השלבים החשובים ביותר בהליך הוא להכין את תערובת החרוזים מולטיפלקס שלך ממניות החרוזים האישיים שלך ולוודא שאתה עושה את זה נכון. אז הליך זה יכול לשמש גם כדי למדוד את היעילות של חיסונים וניטור התגובות החיסוניות לפתוגנים אחרים גם כן.
