פרוטוקול זה מתאר בדיקת אנגיוגנזה נובטת במבחנה המשחזרת תכונות רבות של היווצרות כלי דם ויכולה לשמש לבדיקת תרופות. שיטה זו קלה ליישום במעבדה, חזקה וניתנת להרחבה. יש לו קווי דמיון רבים עם בדיקות באמצעות תאי אנדותל אנושיים ומיקרוספרות.
מודל זה מחקה בחוזקה את הפנוטיפ המציג בחירת תאי קצה אנדותל פגומים ונדידת תאי אנדותל מכוונת המובילה לאנגיוגנזה פתולוגית. העבודה יכולה לספק תובנות לגבי המנגנונים המווסתים אנגיוגנזה מונבטת, הגנים המרכזיים ומסלולי האיתות המעורבים, בעיקר על ידי ביצוע בדיקות גנטיות האתגר העיקרי הוא שמירה על האיכות או הפלוריפוטנציה של תאי גזע עובריים של עכברים בתרבית. בדיקה סדירה של שלבי הפלוריפוטנציה והמורפולוגיה של קווי התאים חשובה.
חשוב גם לבצע קריוטיפ של קווי התא כפי שהם נוטים בתרבית לאבד או להשיג כרומוזומים. התחל על ידי ציפוי באר אחת מתוך שש צלחת תרבית תאי באר עם 500 מיקרוליטר של תמיסת 0.1% ג'לטין ומניחים אותו באינקובטור פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן לשטוף את צלחות מצופה ג'לטין עם PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של CM מוכן טרי פלוס מינוס בינוני.
כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי גזע עובריים בעכבר או mESCs, טריפסינזה את צלחת תרבית התאים עם חיץ TVP 10x למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום התמיינות מזודרם לפני העברתם לצלחת שש בארות מצופות ג'לטין למשך 30 דקות כדי לאפשר לפיברובלסטים העובריים של העכבר להתחבר בזמן שה- mESCs נשארים בהשעיה. מעבירים את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר לפני ספירת תאים חיים באמצעות המוציטומטר נויבאואר בצבע כחול טריפאן.
לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא בנפח מתאים של מדיום התמיינות mesoderm. הכינו ארבע צלחות פוליסטירן בעלות חיבור נמוך בקוטר 94 מ"מ על ידי הוספת 15 מיליליטר מים סטריליים לתחתית.
לאחר העברת תרחיף התא למאגר פלסטיק סטרילי, יש להעמיס ארבע עמדות של פיפטה רב ערוצית עם 22 מיקרוליטר של תרחיף תאים לערוץ. הרימו והניחו את המכסה ההפוך של צלחת ה-94 מ"מ על המשטח הנקי של ארון הזרימה כשהצד הפנימי פונה כלפי מעלה. הניחו 40 טיפות של תרחיף התא על המשטח הפנימי של כל מכסה והפכו בזהירות את המכסה ללא הפרעה כדי להניח אותו בחזרה על המנה, כך שהטיפות פונות למים.
לדגור על הכלים באינקובטור פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים, בהתחשב בכך כיום הבידול אפס. לאחר ארבעה ימי דגירה, אספו את הטיפות התלויות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר באמצעות פיפטה P1000. תן EB משקעים לתוך הצינור לפני הסרת supernatant.
יש להשהות מחדש את ה-EBs בשלושה מיליליטר של מדיום התמיינות כלי דם פי 2 לפני העברה וחלוקה אחידה של מתלי EB בכלי מצופה אגר בקוטר 60 מ"מ. דוגרים על הכלים באינקובטור פחמן דו חמצני עד היום התשיעי עם רענון בינוני כל יומיים. הכינו צלחת תרבית של 35 מ"מ על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום ההנבטה לתחתיתה.
כדי לגרום לג'לציה, לדגור על המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אספו EBs בני תשעה ימים מצלחת אגר אחת בצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוציאו את הסופרנטנט. משעים מחדש את ה- EBs בשני מיליליטר של מדיום הנבטה קר כדי להעביר לצלחת התרבית המצופה בשכבה הראשונה של מדיום הנבטה.
פזרו את ה-EBs על כל הצלחת, וודאו שהם נמצאים במרחק שווה זה מזה. היווצרות הנבטים הראשונה צריכה להיות ניכרת לאחר הדגירה במשך כ 24 עד 48 שעות. ביום ה-12, השתמשו במרית כדי להעביר בזהירות את ג'ל הקולגן המכיל EBs למגלשת זכוכית.
מוציאים את עודפי הנוזלים עם פיפטה ומייבשים את הג'ל על ידי הנחת יריעת גזה של פשתן ניילון וכרטיסי סינון סופגים על גבי הג'ל. הפעל לחץ עם משקל של 250 גרם במשך שתי דקות. לאחר מכן הסירו את ניירות הניילון כדי לאפשר לשקופיות להתייבש באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הייבוש, יש לתקן את ה-EBs באמצעות תמיסת אבץ למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסירו את הקיבוע לפני שטיפת המגלשות חמש פעמים עם PBS. חדרו ל-EBs ול-PBS המכילים 0.1% Triton X-100.
לאחר 15 דקות, הסר את פתרון החדירה כדי לשטוף את המגלשות חמש פעמים עם PBS במשך חמש דקות. יש לדגור על ה-EBs במאגר החוסם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן הראשוני המדולל במאגר החוסם ודגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר מכן דגרו על המגלשות עם נוגדן משני נגד עכברוש אלקסה 555 בחיץ חוסם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות ופעם אחת במים לפני הרכבתן למיקרוסקופיה. בדיקת אנגיוגנזה נובטת תלת ממדית בוצעה על שלושה EBs עם שתי תרופות, DC101 ו- DAPT.
שתי התרכובות חסמו בהדרגה את האנגיוגנזה במודל EB עם ריכוזים הולכים וגדלים. הריכוזים השונים של תרופות ב- EBs הראו כי מינונים גבוהים של DC101 מעכבים את מספר ואורך נבטי כלי הדם. ל-DAPT היו השפעות הפוכות במינון של מיקרומול אחד לליטר.
DAPT הגדיל מאוד את מספר תאי קצה האנדותל לכל נבטי כלי דם בעלי פנוטיפ מוטעה אפילו במינונים נמוכים, בהשוואה ל- DC101. נבטי כלי דם פגומים נצפו בטלנגיאקטזיה דימומית תורשתית EBs מבקרת ACVRL1 ובגנוטיפים הטרוזיגוטיים ACVRL1 עם פנוטיפים רבים של הטעיה הנובטים בזוויות אקראיות ביחס לכלי האב. תערובות של קו mESC מסוג פרא ביחס של אחד לאחד עם קו מסוג פרא mESC ללא תווית, הובילו לתרומה שווה לתאי קצה האנדותל המובילים.
ניתוח מיקרוסקופי של EB כימרי מייצג זה נערך כדי לזהות את המקור הגנוטיפי של תאי קצה האנדותל המובילים. כדי לכמת את כיסוי תאי הקיר של נבט כלי הדם, תוקנו ונצבעו EBs עבור סמני תאי אנדותל, PECAM, וסמן תאי קיר, אקטין שריר חלק אלפא. תמונת הגדלה גבוהה גילתה כי נבט כלי בודד אחד היה מוקף בתאי קיר.
הטרנספורמציה הבינארית בוצעה לאחר הפרדת ערוצי צבע וכומת היחס בין כלי הדם החיוביים של PECAM המכוסים על ידי תאי קיר חיוביים מסוג אלפא SMA. הרקע הגנטי של קו תאי הגזע העוברי הוא גם גורם מפתח שהחוקרים חייבים לקחת בחשבון מכיוון שקווים מסוימים נובטים טוב יותר מאחרים. שיטה זו יכולה לשמש לביצוע בדיקות גנטיות באמצעות גישות RNAi או בנק של תאי גזע עובריים של עכברים המכילים מוטציות גנטיות.
