אנו מודים לקריסטין ג&#39;ונסון לעבודה הגרפית.

כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים מוצגים ולאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון ונערכים בהתאם להמלצותיה של האגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC). הקפד להשתמש מכשור סטרילי וtechniqure ספטית בעת ביצוע ההליך. 1 הכנת פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 10 מ&quot;ג של סוקרלפט ו60 מ&quot;ג של Hydron עם מרית ניע סטרילי. מניחים בmicrocentrifuge צינורות נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסה מרובעת 1 סנטימטר של רשת לתוך צלחת 10 סנטימטר סטרילי. היפוך כל כך רשת נשענת על מכסה רדוד. מניח בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של אתנול לHydron והמערבולת לפחות 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות המתאימה של גורם גדילה (סטנדרטי: 20 מיקרוגרם לbFGF, 50 מיקרוגרם לVEGF) לסוקרלפט ובקצרה מערבולת. גורם גדילת חנות ב-80 ° C מקפיא בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. כרכי נוזל הוסיפו צריכים להיות מינימום של 20 μl כדי להבטיח סוקרלפט היא הרטיבה לגמרי, אבל לא יעלו על 50 μl. נפח גדול יותר הופך את האידוי של הנוזל בשלב הבא קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תערובת סוקרלפט למאייד צנטריפוגלי על החום נמוך עד שהתערובת יבשה לחלוטין, בדרך כלל 30-50 דקות בהתאם לכמות של נוזל המשמשת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התערובת ללחות שיורית עם הקצה החד של מרית סטרילי. התערובת צריכה להרגיש &quot;פריכה&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה החד של המרית כדי לשבור את תערובת סוקרלפט בתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של Hydron לסוקרלפט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל האופי צמיג של Hydron, לחתוך את הקצה מקצה pipet 200 μl ולאחר מכן לצייר ולשחרר את 10 μl לפני pipetting למעלה שוב ומוסיף לסוקרלפט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להשתמש ירק כפוףאולא לערבב Hydron וסוקרלפט ומסירים מצינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את התערובת בצד התחתון של הקצה של המרית הכפופה ולאחר מכן לסובב את הצינור בעת הציור את המרית לאורך הקיר של הצינור. התערובת תתייבש במהירות כל כך חייב להיעשות צעד זה ביעילות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את התערובת על גבי הרשת מוכנה באמצעות מלקחיים כדי להחזיקו במקום. התערובת צריכה להיות גם שכבה ולמלא לתוך החורים של הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את המרית הכפופה לHydron הצינור המכיל ולהשתמש בו מעיל משני צידי הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשת המצופה נשענת על צד נגד קצה הצלחת ולאפשר ייבוש ב RT עבור 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרשת במקפיא -20 ° C או פנה מייד לשלב הבא. שמור רשת בתוך צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 35 מ&quot;מ בתוך צלחת פטרי הגדולה יותר, המכסה. השתמש בזוג המלקחיים למשוך בזהירות את הסיבים של הרשת בנפרד על צלחת 35 מ&quot;מ. ג כדורים תועיםייגבה מהצלחת הגדולה יותר בסוף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו כדורים לאחידות בהיקף. תהליך התשואה של כ 250 כדורים ובכך המינון הסטנדרטי לגלולה לbFGF וVEGF הוא 80 ng ו200 ng, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חנות ב35 צלחת מ&quot;מ במקפיא -20 ° C עד 3 חודשים. </li></ol> .2 השתלה כירורגית של פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אזור ניתוח תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ&quot;ג / קילוגרם, intraperitoneal) ומקם את העכבר מתחת למיקרוסקופ כך עין גלויה. בצע קמצוץ הבוהן כדי להבטיח רמה מספקת של הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העין העכבר על ידי הצבת 1 טיפה של פתרון proparacaine על גבי גלגל העין. חכה 20-30 שניות ולהספיג עם תחבושת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Proptose עין העכבר עם # הקהה להיות בטוח לעזוב את העור בין מלקחיים ועין 1 מלקחיים תכשיטנים. חשוב לשפוט את הלחץ המופעל בצורה נכונה.60; מחזיק את העין בחוזקה מדי יגרום לו להיות אדום ומגורה, ואילו מדי לאבד את האחיזה תאפשר עין לנוע במהלך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בmicroknife 30 ° לעשות חתך לתוך הקרנית כ 1 מ&quot;מ מימבוס. החתך צריך להיות 1-2 מ&quot;מ אורך. חתך צריך להיות עמוק מספיק כדי לחדור מעבר לשכבת האפיתל לmidstroma אבל לא כל כך עמוק כדי לקרוע את העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין פון GRAEF לעשות כיס בניצב לחתך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את הסכין מתחת לשכבה הקרנית באתר החתך ובעדינות לעבוד סכין ובהעבר אותו לאורך החתך להגדלת החלל, ובכך ליצור הכיס. זה עוזר להזיז את העכבר, כמו גם להיות מסוגל לעבוד עם העקמומיות של העין. היזהר שלא לדחוף כלפי מטה עם הקצה כדי למנוע פקיעת עין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב המלקחיים של צורף # 5 עם proparacaine לקחת גלולה עד מתוך צלחת. מניחים גלולה על העין. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את סכין פון GRAEF עם proparacaine ולהעביר חלק מנוזל על גלולה כדי להפוך אותו גומי וגמיש. להסיר לחות עודפת עם תחבושת או מטלית כותנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הכדור לתוך הכיס באמצעות סכין פון GRAEF לדחוף אותו פנימה מתחת לשכבת הקרנית. ברגע שכל גלולה היא בפנים, להפעיל את הצד השטוח של סכין פון GRAEF על אתר כדי לבדוק שהגלולה היא מאובטחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עין עם משחה אנטיביוטית משולשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפכתי את העכבר ולחזור על ניתוח בעין השנייה. </li></ol> .3 כימות של הקרנית neovascularization. השאר בעלי חיים כדי לפתח כלי מעל פרק זמן מוגדר. היום לדירוג כלי תלוי בגורם גדילה בשימוש. הכיתה bFGF ביום 5 וVEGF חלש יותר ביום .6 יום ההשתלה הוא יום 0. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם Avertin (400-500 מ&quot;ג / קילוגרם, intraperitoneal). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ מנורת הסדק להגר&quot;אדינג. יש עינית אחת reticule, קווים בתוך העינית משמשת ככולים עזר למדידה לכמת אונייה שאורכה ומרחק סביב ההיקף של העין שהכולים צצו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העכבר מול היקף, מיקום עכבר ולכן העין נראית בעיניים עם גלולה ישירות קדימה. לייצב את הראש בין האגודל לאצבע ולכן העור מתהדק על פנים והעין proptosed מעט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ציר y של reticule לאורך כלי limbal ישירות מתחת גלולה. מדוד את האורך של כלי הסתעפות כלפי מעלה לכיוון כדורים. להקליט מדידה זו בעשירית מילימטרים ולייעד אונייה שאורכה (VL) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל או העכבר או ארנק, כך שהמרחק סביב העין שהכלים האלה צצו מתבהר. זה הכי קל לחשוב על עין כפני שעון במרווחים של 1 עד 12. מיועד שעת שעון מספר זה (CH) (איור 1B). זה יכול להיות מספר או שברים של 0.25 (למשל, 2, 2.25, 2.5 או 2.75) שלמים. הערה: CH הוא סובייקטיבי. לדוגמא, חלקם עשוי למדוד את המרחק סביב העין שיכלול את כל נבטו מימבוס ואילו אחרים עשויים להפסיק מדידה בנקודה שבי האונייה שאורכה הוא מחצית מקסימלי כלי. הגורם החשוב הוא להיות עקבי עם איך אחד בוחר לכיתה. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51375/51375fig1.jpg" /> איור 1 כימות neovascularization קרנית. () 80 ng bFGF גלולה הושתלה בעכבר / 6J C57BL מראה מנורת סדק reticule אוריינטציה למדוד אונייה שאורכה. VL = 0.9 מ&quot;מ. (ב) reticule מנורת הסדק מראה עין אותו מסובב למדוד שעת שעון. CH = 3.25. אזור ספינה מחושב = 1.84 מ&quot;מ 2. תמונות אלה שופרו באופן דיגיטלי על מנת לאפשר לתוספת של סכמטי reticule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51375/51375fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את שטח הכלי (VA) תוך שימוש בנוסחה הבאה, המבוסס על השטח של סגלגל (הערה, זה עוזר לשמור את זה בחשבון בעת ​​דירוג.) אקספרס VA במילימטרים בריבוע. הנוסחה היא כדלקמן: שעת x 0.2 π = אזור כלי שעון Vessel אורך X </li></ol>

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> J. Cell Biol. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-promoting+phorbol+esters+induce+angiogenesis+in+vitro.">Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro.</a> Cell. 42, 469-477 (1985).</li><li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation.">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> J. Cell Biol. 143, 1341-1352 (1998).</li><li>Nicosia, R. F., Tchao, R., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histotypic+angiogenesis+in+vitro:+light+microscopic,+ultrastructural,+and+radioautographic+studies.">Histotypic angiogenesis in vitro: light microscopic, ultrastructural, and radioautographic studies.</a> In Vitro. 18, 538-549 (1982).</li><li>Wong, K. H., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+models+of+vascular+functions.">Microfluidic models of vascular functions.</a> Annu Rev Biomed Eng. 14, 205-230 (2012).</li><li>Sandison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+microscopic+study+of+living+growing+tissues+by+the+introduction+of+a+transparent+chamber+in+the+rabbit's+ear.">A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear.</a> Anat. Rec. 28, 281-287 (1924).</li><li>Jain, R. K., Schlenger, K., Hockel, M., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+angiogenesis+assays:+progress+and+problems.">Quantitative angiogenesis assays: progress and problems.</a> Nat. Med. 3, 1203-1208 (1997).</li><li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay.">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (10), 2545-2550 (2007).</li><li>Gimbrone, M. A., Leapman, S. B., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+in+vivo+by+prevention+of+neovascularization.">Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization.</a> J. Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+growth+and+neovascularization:+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea.">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li><li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice.">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li><li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+rats+to+corneal+lesions+after+injectable+anesthesia.">Susceptibility of rats to corneal lesions after injectable anesthesia.</a> Med Comp. 55 (2), 175-182 (2005).</li><li>Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reversible+cataract+induced+by+xylazine+and+by+ketamine-xylazine+anesthesia+in+rats+and+mice.">Acute reversible cataract induced by xylazine and by ketamine-xylazine anesthesia in rats and mice.</a> Exp. Eye Res. 42, 331-337 (1986).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

ישנם מספר צעדים קריטיים בביצוע assay קרנית מוצלח. הוא עושה הראשון כדורים אחידים אפשר להשתיל ומגרים כלי. החלקים החשובים ביותר של הכנת גלולה הם 1) שימוש בגורם גדילה ללא ספק; 2) להבטיח תערובת טובה של גורם גדילה עם סוקרלפט וHydron ו3) נע התערובת הסופית במהירות אבל בזהירות מצינור E...

התהליך של אנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים בצורה קודמת נותרים אלה, הוא מורכב מאוד והוא מוסדר על ידי מספר גורמים במשק ששולטים בצעדים שונים של הנבטה הכלי והמורפוגנזה. אנגיוגנזה מופעלת עקב שינוי באיזון בין גורמים בעד ונגד אנגיוגנזה, איזון, כי בדרך כלל שומר על כלי הדם במצב שקט. אנגיוגנזה במבוגרים מתרחשת בתנאים מסוימים פיסיולוגיים כמו במהלך מחזור השחלות הנקבה או בתהליכי תיקון כגון ריפוי פצעים והתחדשות רקמות. עם זאת, זה גם סימן היכר של כמה פתולוגיות הכוללים גידולים ממאירים, מחלות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. המעורבות של אנגיוגנזה בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים אלה הופכת אותו לנושא חשוב למחקר וליעד אטרקטיבי לטיפול. בשל המורכבות של אנגיוגנזה ומעורבותם של כמה ceLLS וגורמים בתהליך, כוללים תאים אנדותל, pericytes, תאים במחזור ותאי סטרומה, במודלים חוץ גופית יישארו מוגבלים ולא יכולים לשחזר את microenvironment הייחודי in vivo. העיקרי במבחני חוץ גופית של אנגיוגנזה מתמקדים במידה רבה בהתבוננות השפעות ישירות על תאי האנדותל ומדידת צעדים מסוימים בתהליך angiogenic בתנאים מבוקרים. מבחני אלה כוללים את הכימות של תא האנדותל התפשטות 1, הגירה 2, היווצרות רשת 3, היווצרות צינור 4 ומבצבצות spheroids 5. דגמי Ex vivo, שלא כמו במבחנה אלה, הם מורכבים יותר ולשלב סוגים שונים של תאי רקמה, דוגמא ש assay טבעת אב העורקים 6. עם זאת, כמו מערכות אחרות, זה לא יכול ללכוד את תרומתם של תאים במחזור וסטרומה הטבעית של תאי האנדותל כקיים בגוף חי. ניסיונותללמוד אנגיוגנזה תחת זרימה לחקות את הגדרת in vivo מבוצעים באמצעות מערכות microfluidic 7, אפילו אולם מבחני אלה, למרות שהשתפר מאוד, עדיין לא מצליחין להסביר את כל התאים קיימים בגוף חי. בשל המגבלות של במבחנה ולשעבר מודלים אנגיוגנזה vivo, in vivo מודלים יישארו הבחירות אמינות יותר ללימודי אנגיוגנזה. דוגמאות למודלים אלה כוללים השתלה של תאים שקופים, &quot;חלונות&quot;, המאפשרים ההדמיה של כלי דם גדלו תחת מיקרוסקופ 8, CAM שתלים תת עורית בהזרקה כגון היווצרות matrigel וכלי ברקמות נורמליות כמו אוזן עכבר וקרום chorioallantoic העוף ( ). עם זאת, אחד מדגמי אנגיוגנזה in vivo המקובלים וכמותיים ביותר הוא assay קרנית neovascularization micropocket המתואר כאן, המנצל את באופן טבעי avascularקרנית כ&quot; מסך &quot;כדי לחזות ולהעריך צמיחת angiogenic חדשה 9. כאן אנו מתארים את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים. בתחילה המודל המשמש למדידת גירויי angiogenic ספציפיים בקרניות ארנב. הדבר נעשה על ידי החדרת חתיכות גידול לתוך ההומור המימית של הלשכה הקדמית של העין הארנב ונמדד neovascularization מושרה גידול 11. עם זאת, assay מאוחר יותר התפתח לחוקר את ההשפעות של גידול ספציפי גורמי 10 לציין טוב יותר ולתקנן את השפעת angiogenic. על מנת לשחרר את גורם הגדילה בעיניים, כדורים בשחרור איטי המכילים כמויות ידועות של גורמי גדילת angiogenic שמשו במקום רקמות. הזמינות של חלבוני angiogenic רקומביננטי מטוהרים כגון bFGF או VEGF אפשרה את השימוש בם כמטרות ספציפיות של modulaters אנגיוגנזה 12. בתחילה, assay היהמשמש בעיקר בארנבות, שהם קלים יותר לעבוד עם בשל גודלם, אך מאוחר יותר המודל תורגם לעכברים; מודל חיה קטן יותר ופחות יקר. עובר מארנב לעכברים סיפק יתרון חשוב של להיות מסוגל להשתמש בבעלי חיים מניפולציות גנטיים, ובכך ליצור תחום חדש של מחקר למרכיבים הגנטיים המשפיעים על היווצרות כלי דם 13. בנוסף לשימוש מקובל יותר של assay קרנית בלימוד אנגיוגנזה, תהליכים ביולוגיים אחרים יכולים גם נחקר באמצעות מבחני שונה. לדוגמא, מחקרים של lymphangiogenesis התאפשרו באמצעות ההשתלה של כדורים במינון bFGF נמוכים שאפשרו להדמיה של כלי הלימפה דרך סמנים מולקולריים ספציפיים 14. בנוסף, assay זה סיפק אמצעי כדי להעריך את ההשפעות של קרינה על אנגיוגנזה 15. לסיכום, assay אנגיוגנזה micropocket הקרנית הוא כמותי, נציגroducible, הערכה גמישה של אנגיוגנזה in vivo. יתרון עיקרי של assay זה הוא שהמדידה של כלי רקע היא מיותרת, משום שהכולים גדלים על רקמות באופן טבעי avascular. אנו מתארים כאן את הפרוטוקול של assay זה בפרטים ולדון בתרחישים שונים שיכול להתרחש. Assay כולל 3 מקטעים בדידים. כאן אנו מתארים את ההכנה של כדורי גורם כלול צמיחה, השתלה כירורגית שלאחר מכן ולבסוף שיטה לכמת את צמיחת neovascular וכתוצאה מכך.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

Assay micropocket קרנית העכבר הוא assay חזק וכמותיים in vivo להערכת אנגיוגנזה. על ידי שימוש בכדורים בשחרור איטי סטנדרטיים המכילים גורמי גדילה ספציפיים שמעוררים צמיחת כלי דם בכל הקרנית באופן טבעי avascular, אנגיוגנזה ניתן למדוד ולכמת. ב assay זה התגובה angiogenic נוצרה במהלך כמה ימים, תלוי בסוג והמינון של גורם גדילה בשימוש. האינדוקציה של neovascularization מופעלת בדרך כלל על ידי או גורם בסיסי גידול פיברובלסטים (bFGF) או גורם כלי דם האנדותל צמיחה (VEGF). על ידי שילוב של הגורמים הללו צמיחה עם סוקרלפט וHydron (פולי המו (פולי (methacrylate 2-Hydroxyethyl))) וליהוק התערובת לתוך כדורים, הם יכולים להיות מושתלים בניתוח בעין העכבר. כדורים אחידים אלה לאט-לשחרר גורמי גדילה על פני חמישה או שישה ימים (bFGF או VEGF בהתאמה) המאפשרים תגובת angiogenic מספיקה הנדרשת לq אזור הספינהuantification באמצעות מנורת סדק. assay זה יכול לשמש ליישומים שונים, כוללים ההערכה של תרופות angiogenic מאפנן או טיפולים, כמו גם השוואה בין רקע גנטי שונה המשפיע על היווצרות כלי דם. חוקר מיומן לאחר תרגול assay זה יכול להשתיל גלולה בפחות מ -5 דקות לכל עין.

תוצאות אופייניות לכדורי bFGF וVEGF בC57BL / 6J angiogenic הנמוך הנורמלי מוצגות באיור 2 א &#39;וב&#39;, בהתאמה. 2E איור מציג את ההתפלגות הנורמלית של אזור הספינה (VA) בC57BL / מתח 6J עם מינונים שונים של הצמיחה הבאות גורמים. 80 כדורי bFGF ng בדרך כלל לגרום לVA של כ 2.0 2 מ&quot;מ, אם כ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye at JoVE.com

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים.

קרנית Micropocket Assay: דגם של אנגיוגנזה בעין העכבר

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

the-corneal-micropocket-assay-a-model-of-angiogenesis-in-the-mouse-eye

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.5K Views.  Boston Children's Hospital.  הפרוטוקול מתאר את assay micropocket הקרנית כפי שפותח בעכברים. 

Video: The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

עצב הראייה קראש פגיעה דגם Murine לחקר הישרדות רשתית תא גנגליון

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

איתור של הפלאק מדלקת עצבים במודל מחלת אלצהיימר עכבר

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

מכתים Immunofluorescent הר שלם של רשתית עכבר ילודים לחקר אנגיוגנזה<em&gt; בvivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב<em&gt; Laevis Xenopus</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...