Bu protokol, tek kılavuzlu RNA ve CAS9 tarafından indüklenen çift iplikçikli bir kopmanın onarımı sırasında meydana gelen mutasyonları tanımlamanıza yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, belirli bir genomik lokustaki mutasyonları tespit etmenin uygun maliyetli ve sağlam bir yolu olmasıdır. Örnek olarak insan keratinositini kullanıyoruz, ancak bu protokol herhangi bir transfektabl hücre hattına uyarlanabilir.
Bu protokolü gösteren, laboratuvarımızdan bir lisans asistanı olan Taylor Bugbee olacaktır. Başlamak için, kültür HFK LXSN ve HFK 8E6 hücreleri, insan keratinosit büyüme takviyesi ve% 1 penisilin streptomisin içeren keratinosit kültür ortamı içeren bir ceket inkübatöründe% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 10 santimetrelik plakalarda. Kültür ortamını üç mililitre tripsin-EDTA ile değiştirin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, tripsini eşit miktarda FBS takviyeli medya ile nötralize edin. Şimdi, hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. İnsan keratinosit büyüme takviyesi ile 10 mililitre keratinosit kültür ortamı ile hücreleri yeniden askıya alın ve bir hemositometre ile hücrelerin konsantrasyonunu belirleyin.
Daha sonra, insan keratinosit büyüme takviyesi ve% 1 penisilin streptomisin ile dört mililitre keratinosit kültür ortamında HFK LXSN ve HFK 8E6 hücreleri için her biri iki plaka tohumlayın. Tohumlamayı takiben, hücreleri bir ceket inkübatöründe 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Transfeksiyon gününde, medyayı üç mililitre antibiyotiksiz takviyeli medya ile değiştirin ve bir ceket inkübatöründe 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin.
Hücreleri transfekte etmek için, transfeksiyon reaktiflerini oda sıcaklığına ısıtın ve kullanmadan önce nazikçe pipetleyin. Her hücre hattı için iki steril 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne uygun miktarda transfeksiyon tamponu yerleştirin ve bunları tüp bir olarak etiketleyin ve sahte transfeksiyon veya tüp iki. Daha sonra, bir tüpe iki mikrogram plazmid DNA'sı eksprese eden, CAS9, tek kılavuzlu, RNA hedefli insan CD4'ü ekleyin ve tamamen karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin.
İkinci tüpe eşit miktarda steril su ekleyin. DNA karışımı ve sahte transfeksiyon veya tüp iki ile bir tüpe uygun miktarda transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bir pipet kullanarak, yavaşça tamamen karıştırın ve kompleksleri oluşturmak için oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin.
Transfeksiyon karışımını plakaya damla damla ekleyin ve transfeksiyon karışımını eşit şekilde dağıtmak için kültür plakasını bir dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Hücreleri tripsinizasyon yoluyla hasat etmek için, kültür ortamını bir mililitre tripsin EDTA ile değiştirin ve üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, tripsini eşit miktarda FBS takviyeli medya ile nötralize edin.
Her hücre plakası için, hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 300 kez G'de eşit alikotlu ve santrifüjlü iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini dizileme için bir mililitre PBS'de bir tüpten ve başka bir tüpte, immünoblot için buz gibi soğuk PBS ile yeniden askıya alın. Transfekte edilmemiş ve transekte HFK hücrelerinde CAS9 ekspresyonunu karşılaştırmak için immünoblot testi yapıldı.
Sonuçlar, transfekte edilmemiş ve transekte HFK hücrelerinin benzer miktarda CAS9 eksprese ettiğini ve transfeksiyon verimliliğinin iki hücre hattı arasında benzer olduğunu göstermektedir. SgRNA/CAS9 transfekte hücrelerinde fosforile histon H2AX S139'un immünofloresan mikroskopi görüntüleri ve transfekte edilmemiş kontrol elde edildi. Sonuçlar, iki çift iplikçik kırılmasının CAS9 SgRNA tarafından indüklendiğini gösterdi.
Genomik varyasyonlar, HFK LXSN ve HFK 8E6'daki mutasyonel olay türlerine göre gruplandırıldı; burada her bir genomik varyasyon grubu ve toplam varyasyon sayısı HFK LXSN ve HFK 8E6 arasında karşılaştırıldı. Sonuçlar, 8E6'nın CAS9 kaynaklı çift iplikçik kırılmaları etrafında 200 kilobaz içindeki genomik varyasyonları arttırdığını ve HPV 8E6'nın çift iplikçik kırılması onarımını deregüle ettiğini ve genomik instabiliteyi arttırdığını gösterdi. İmmünoblotun amacı, veri analizi sırasında göz önünde bulundurulması gereken transfeksiyon verimliliğini ölçmektir.
Transfeksiyon verimliliğine ek olarak, immünofloresan mikroskopi, bir belirteç olarak fosfo-H2AX kullanılarak çift iplikli kırılma indüksiyonunu doğrulamak için kullanılabilir. Örnek olarak HPV 8E6 beta sürümünü kullanıyoruz. Bu teknik, küçük molekül inhibitörleri gibi diğer reaktiflerin neden olduğu mutasyon sıklığı veya tipindeki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.
