Este protocolo ajuda a identificar mutações que ocorrem durante o reparo de uma quebra de dois fios induzida pelo RNA de guia único e CAS9. A principal vantagem desta técnica é que é uma maneira econômica e robusta de detectar mutações em um lócus genômico específico. Usamos a queratinócito humana como exemplo, mas este protocolo pode ser adaptado a qualquer linha celular transfectável.
Demonstrando este protocolo estará Taylor Bugbee, um assistente de graduação do nosso laboratório. Para começar, cultura HFK LXSN e HFK 8E6 células em placas de 10 centímetros a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de jaqueta contendo mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos e estreptomicina de penicilina de 1%. Substitua a mídia cultural por três mililitros de trippsina-EDTA e incubar a 37 graus Celsius por três minutos.
Em seguida, neutralize o trypsin com um volume igual de mídia complementada pelo FBS. Agora, transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos. Re suspenda células com 10 mililitros de mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócitos humanos e determine a concentração de células com hemótmetro.
Depois, semente duas placas cada para células HFK LXSN e HFK 8E6 em quatro mililitros de mídia de cultura queratinócito com suplemento de crescimento de queratinócito humano e estreptomicina de 1%penicilina. Após a semeadura, incuba as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora de jaquetas. No dia da transfecção, substitua a mídia por três mililitros de mídia suplementada sem antibióticos e incuba por duas horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de jaquetas.
Para transfetar as células, os reagentes de transfecção quentes para a temperatura ambiente e pipetá-los suavemente antes de usá-los. Coloque uma quantidade apropriada de tampão de transfecção em dois tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis para cada linha celular e rotule-os como tubo um e transfecção simulada, ou tubo dois. Em seguida, adicione dois microgramas de expressagem de DNA plasmídeo, CAS9, guia único, CD4 humano direcionado ao RNA ao tubo um e pipeta suavemente para misturar completamente.
Adicione um volume igual de água estéril ao tubo dois. Adicione uma quantidade apropriada do reagente de transfecção ao tubo um com mistura de DNA e a transfecção simulada ou tubo dois. Usando uma pipeta, misture-as completamente e incuba-as à temperatura ambiente por 15 a 30 minutos para formar os complexos.
Adicione a mistura de transfecção em termos de gota ao prato e agite suavemente a placa de cultura por um minuto para distribuir uniformemente a mistura de transfecção. Para colher as células por trippsinização, substitua a mídia cultural por um mililitro de trippsina EDTA e incubar a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, neutralizar o trypsin com um volume igual de mídia suplementada pelo FBS.
Para cada placa de células, transfira a suspensão celular para dois tubos de microcentrifuuuge com alíquotas iguais e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos. Após a centrifugação, suspenda a pelota celular de um tubo em um mililitro de PBS para sequenciamento, e em outro tubo, com PBS gelado para imunoblot. O ensaio de imunoblot foi realizado para comparar a expressão CAS9 em células HFK não transtravadas e transectadas.
Os resultados mostram que as células HFK não transtravadas e transectadas expressaram uma quantidade semelhante de CAS9, indicando que a eficiência de transfecção é semelhante entre duas linhas celulares. Foram obtidas imagens de microscopia de microscopia de imunofluorescência de histone H2AX S139 em células transfetônicas SgRNA/CAS9 e controle não transtrafetado. Os resultados indicaram que duas quebras de dois fios foram induzidas pelo CAS9 SgRNA.
As variações genômicas foram agrupadas por tipos de eventos mutacionais em HFK LXSN e HFK 8E6, onde cada grupo de variações genômicas e o número total de variações foram comparados entre HFK LXSN e HFK 8E6. Os resultados mostraram que o 8E6 aumenta as variações genômicas dentro de 200 quilobase em torno das quebras de dois fios induzidos pelo CAS9, indicando que o HPV 8E6 desregulamenta o reparo de quebra de dois fios e aumenta a instabilidade genômica. O objetivo do imunoblot é medir a eficiência da transfecção, que deve ser considerada durante a análise dos dados.
Além da eficiência da transfecção, a microscopia de imunofluorescência poderia ser usada para confirmar a indução de quebra de dois fios usando fosfo-H2AX como marcador. Usamos o beta HPV 8E6 como exemplo. Esta técnica pode ser usada para detectar alterações na frequência ou tipo de mutação causadas por outros reagentes, como inibidores de moléculas pequenas.
