Dieses Protokoll hilft Ihnen, Mutationen zu identifizieren, die während der Reparatur eines Doppelstrangbruchs auftreten, der durch Single-Guide-RNA und CAS9 induziert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine kostengünstige und robuste Möglichkeit ist, Mutationen an einem bestimmten genomischen Ort nachzuweisen. Wir verwenden menschliche Keratinozyten als Beispiel, aber dieses Protokoll kann an alle transfizierbaren Zelllinien angepasst werden.
Dieses Protokoll wird Taylor Bugbee, ein Assistent aus unserem Labor, demonstrieren. Zu Beginn kultivieren HFK LXSN- und HFK 8E6-Zellen in 10-Zentimeter-Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid in einem Jacket-Inkubator, der Keratinozytenkulturmedien mit humanem Keratinozyten-Wachstumspräparat und 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Ersetzen Sie die Nährmedien durch drei Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.
Neutralisieren Sie dann das Trypsin mit einer gleichen Menge an FBS-ergänzten Medien. Übertragen Sie nun die Zellen fünf Minuten lang in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und eine Zentrifuge bei 300 mal G. Resuspendieren Sie Zellen mit 10 Millilitern Keratinozytenkulturmedien mit menschlichem Keratinozyten-Wachstumspräparat und bestimmen Sie die Konzentration der Zellen mit einem Hämozytometer.
Danach werden jeweils zwei Platten für HFK LXSN- und HFK 8E6-Zellen in vier Millilitern Keratinozytenkulturmedien mit humanem Keratinozyten-Wachstumspräparat und 1% Penicillin-Streptomycin ausgesät. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem Jackeninkubator. Ersetzen Sie am Tag der Transfektion die Medien durch drei Milliliter antibiotikafreie Ergänzungsmedien und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einem Jackeninkubator.
Um die Zellen zu transfizieren, erwärmen Sie Transfektionsreagenzien auf Raumtemperatur und pipettieren Sie sie vorsichtig vor der Verwendung. Legen Sie eine angemessene Menge Transfektionspuffer in zwei sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen für jede Zelllinie und kennzeichnen Sie sie als Röhrchen eins und simulierte Transfektion oder Röhrchen zwei. Fügen Sie dann zwei Mikrogramm Plasmid-DNA-exprimierendes, CAS9, Single-Guide, RNA-zielgerichtetes menschliches CD4 hinzu, um eins zu rösten, und pipettieren Sie vorsichtig, um es vollständig zu mischen.
Fügen Sie eine gleiche Menge steriles Wasser zu Tube zwei hinzu. Fügen Sie eine angemessene Menge des Transfektionsreagenzes zu Röhrchen eins mit DNA-Mischung und der simulierten Transfektion oder Röhrchen zwei hinzu. Mit einer Pipette vorsichtig vollständig vermischen und bei Raumtemperatur 15 bis 30 Minuten inkubieren, um die Komplexe zu bilden.
Fügen Sie die Transfektionsmischung tropfenweise auf die Platte und schütteln Sie die Kulturplatte vorsichtig für eine Minute, um die Transfektionsmischung gleichmäßig zu verteilen. Um die Zellen durch Trypsinisierung zu ernten, ersetzen Sie Kulturmedien durch einen Milliliter Trypsin EDTA und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Neutralisieren Sie dann Trypsin mit einer gleichen Menge an FBS-ergänzten Medien.
Übertragen Sie die Zellsuspension für jede Zellplatte fünf Minuten lang auf zwei Mikrozentrifugenröhrchen mit gleichen Aliquots und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G. Nach der Zentrifugation suspendieren Sie das Zellpellet aus einem Röhrchen in einem Milliliter PBS für die Sequenzierung und in einem anderen Röhrchen mit eiskaltem PBS für Immunoblot. Es wurde ein Immunoblot-Assay durchgeführt, um die CAS9-Expression in nicht transfizierten und transektierten HFK-Zellen zu vergleichen.
Die Ergebnisse zeigen, dass nicht transfizierte und transektierte HFK-Zellen eine ähnliche Menge an CAS9 exprimierten, was darauf hindeutet, dass die Transfektionseffizienz zwischen zwei Zelllinien ähnlich ist. Immunfluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von phosphoryliertem Histon H2AX S139 in SgRNA/CAS9-transfizierten Zellen und untransfizierter Kontrolle wurden erhalten. Die Ergebnisse zeigten, dass zwei Doppelstrangbrüche durch CAS9 SgRNA induziert wurden.
Genomische Variationen wurden nach Arten von Mutationsereignissen in HFK LXSN und HFK 8E6 gruppiert, wobei jede Gruppe genomischer Variationen und die Gesamtzahl der Variationen zwischen HFK LXSN und HFK 8E6 verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass 8E6 die genomischen Variationen innerhalb von 200 Kilobasis um die CAS9-induzierten Doppelstrangbrüche erhöht, was darauf hindeutet, dass HPV 8E6 die Reparatur von Doppelstrangbrüchen dereguliert und die genomische Instabilität erhöht. Der Zweck von Immunoblot ist es, die Transfektionseffizienz zu messen, die bei der Datenanalyse berücksichtigt werden sollte.
Zusätzlich zur Transfektionseffizienz könnte die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Induktion von Doppelstrangbrüchen mit Phospho-H2AX als Marker zu bestätigen. Wir verwenden die Beta HPV 8E6 als Beispiel. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen der Mutationshäufigkeit oder des Typs zu erkennen, die durch andere Reagenzien wie niedermolekulare Inhibitoren verursacht werden.
