Name: polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis at JoVE.com

המחברים מודים לי צ'ינג על עזרה עם הקלטת אודיו. המחקר נתמך על ידי ראשונית של טקסס טק האוניברסיטה למדעי הבריאות מרכז, על ידי מרכז המצוינות במדעי המוח Translational ו הרפוי (CTNT) להעניק PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; בחלקו על ידי מענק NIH R01AI099380 ג'יימס K.Z. ג האפמן, קריסטין ר' באקה היו מלומדים CISER (מרכז עבור אינטגרציה של גזע חינוך & מחקר), נתמכו על-ידי התוכנית.

<ol>
	<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Capewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Trypanosoma+brucei+Total+and+Polysomal+mRNA+during+Development+within+Its+Mammalian+Host.">Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.</a> PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).</li><li>Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+immune+responses:+from+transcripts+to+translatomes.">Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes.</a> Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).</li><li>Ennis, H. L., Lubin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cycloheximide:+Aspects+of+Inhibition+of+Protein+Synthesis+in+Mammalian+Cells.">Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells.</a> Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).</li><li>Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).</li><li>Zuccotti, P., Modelska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Translatome+with+Polysome+Profiling.">Studying the Translatome with Polysome Profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).</li><li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).</li><li>Arava, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+translation+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nanoCAGE+reveals+5'+UTR+features+that+define+specific+modes+of+translation+of+functionally+related+MTOR-sensitive+mRNAs.">nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs.</a> Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).</li><li>Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+shows+that+miR-430+reduces+translation+before+causing+mRNA+decay+in+zebrafish.">Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish.</a> Science. 336 (6078), 233-237 (2012).</li><li>Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nip7p+interacts+with+Nop8p,+an+essential+nucleolar+protein+required+for+60S+ribosome+biogenesis,+and+the+exosome+subunit+Rrp43p.">Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p.</a> Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Gkogkas, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-related+deficits+via+dysregulated+eIF4E-dependent+translational+control.">Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control.</a> Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).</li><li>Robichaud, N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+and+the+cancer+cell+response+to+stress.">Translational control and the cancer cell response to stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).</li><li>Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+muscle+protein+synthesis+and+the+effects+of+catabolic+states.">Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).</li><li>Ishimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+function.+Ribosome+stalling+induced+by+mutation+of+a+CNS-specific+tRNA+causes+neurodegeneration.">RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration.</a> Science. 345 (6195), 455-459 (2014).</li><li>Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+RNAs+repress+translation+after+initiation+in+mammalian+cells.">Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells.</a> Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).</li><li>Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+dynamics+revealed+by+genome-wide+profiling+of+ribosome+footprints+in+Arabidopsis.">Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).</li><li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).</li><li>De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+in+trypanosomatids.">Gene expression regulation in trypanosomatids.</a> Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).</li><li>Alves, L. R., Goldenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+related+to+stress+response+and+differentiation+in+protozoa.">RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa.</a> World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).</li><li>De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+differentiation+in+Leishmania+lifecycle+progression:+post-transcriptional+control+conducts+the+orchestra.">Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra.</a> Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).</li><li>Soto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-dependent+translation+of+histone+mRNAs+is+the+key+control+point+for+regulation+of+histone+biosynthesis+in+Leishmania+infantum.">Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum.</a> Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).</li><li>McNicoll, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3+'-untranslated+region+elements+regulate+stage-specific+mRNA+accumulation+and+translation+in+Leishmania.">Distinct 3 '-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).</li><li>Folgueira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+efficiencies+of+the+two+Leishmania+infantum+HSP70+mRNAs,+differing+in+their+3+'-untranslated+regions,+are+affected+by+shifts+in+the+temperature+of+growth+through+different+mechanisms.">The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 '-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).</li><li>Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+developmentally+regulated+noncoding+RNAs+in+Leishmania.">A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania.</a> Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).</li><li>Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transfection+of+the+human+parasite+Leishmania+major+delineates+a+30-kilobase+region+sufficient+for+extrachromosomal+replication+and+expression.">Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression.</a> Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).</li><li>Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+SecA+association+with+signal+sequences+in+ribosome-bound+nascent+chains:+a+potential+role+for+SecA+in+ribosome+targeting+to+the+bacterial+membrane.">Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+Fractionation+to+Analyze+mRNA+Distribution+Profiles.">Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles.</a> Bio Protocols. 7 (3), (2017).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+CFTR+transmembrane+span+integration+by+disease-causing+mutations.">Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).</li><li>Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+CFTR+is+predominantly+cotranslational.">Folding of CFTR is predominantly cotranslational.</a> Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).</li><li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress.">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Controls+Mitochondrial+Dynamics+and+Cell+Survival+via+MTFP1.">mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1.</a> Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Polysome fractionation על ידי הדרגה סוכרוז בשילוב עם ה-RNA, אנליזת חלבונים שברים היא שיטה חזקה כדי לנתח מצב translational mRNAs בודד או כל translatome, כמו גם תפקידים של חלבון גורמי ויסות translational מכונות במהלך למצב רגיל פיזיולוגיים או מחלה. פרופיל polysomal היא טכניקה מתאים במיוחד ללמוד תקנה translational אורגניזמים כגון trypanosomatids כולל לישמניה איפה בקרת גנים ברמת השעתוק העדרותו במידה רבה, הכונה ביטוי מתרחשת בעיקר במהלך התרגום.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול fractionation polysome המשמש על שלושה דגמים: טפילים לישמניה , בתרבית תאים אנושיים ורקמות העכבר. הצעד fractionation polysome הוא בעצם זהה עבור אורגניזמים שונים השתמשו במחקר זה; עם זאת, ההכנה lysate יש כמה הבדלים. לישמניה התאים גדלים בתרבות נוזלי נאסף על ידי צנטריפוגה, תאים ייספרו לפני פירוק כדי להבטיח שוויון טעינה במעבר הצבע. תאים אנושיים יכולים להיות שטופים lysed ישירות על הצלחת. ההעמסה שווה נשלטת על ידי צפיפות אופטית. רקמות העכבר דורשים מהמגן דאונס עבור פירוק יעיל בעוד במקרה של לישמניה, תאים אנושיים, זה מספיק כדי להעביר אותם דרך המחט 23-מד.
ריאגנטים כל פעם צריך להיות RNase פרוטאז חינם. השווינו את הפארין והמעכב RNase כמו מעכבי פעילות RNase ב lysates cytoplasmic. מצאנו כי שניהם ריאגנטים ביעילות לחסום RNase. עם זאת, הפארין משפיע במורד יישומים כגון cDNA והכנה RT-qPCR. כתוצאה מכך, הכנה של RNA דורש שלב טיהור נוסף כאשר משתמשים הפארין. לדעתנו, החומר המדכא RNase בחירה נוחה יותר, ניתן להשתמש ביעילות polysome פרופיל פרוטוקול.
פרופיל polysomal הוא עמל רב, אשר הוא מגבלה עיקרית של השיטה. עד שישה מעברי צבע ניתן להכין באותו זמן. Fractionator ההדרגתי מפיק 144 שברים צריך להיות מעובד בתקופה קצרה של זמן. ניתוח של שברים בודדים ניתן זמן רב ויקר מידי. לכן, שילוב של שברים בודדים לתוך polysomes מראש, polysomes קל וכבד מספק דרך מייגעת פחות ומהירה כדי להעריך translational פעילות של mRNAs בודדים. התוצאות שלנו RT-qPCR בשברים משולבים מותר לנו לזהות הבדלים בין translatability של mRNAs שונים הן לישמניה והן תאים הלה (איורים 2, 3). עם זאת, אם יש צורך ברזולוציה עדינה יותר, ואז ניתוח של שברים בודדים ניתן לבצע.
ריבוזום פרופיל בשיטה אחרת כדי ללמוד את המצב translational של mRNA והיא מבוססת על מדידה של ייצור החלבון באמצעות רצף של קטעים mRNA מוגן על-ידי ריבוזום38. טכנולוגיה זו מספקת מידע כמותי שיוך רצפי mRNA ספציפי שברים polysomal מתורגם במדגם, יכול לספק מידע מדויק על מצב translational mRNAs ברזולוציה codon בהשוואה polysome פרופיל טכנולוגיה. עם זאת, polysome פרופיל יכול לשמש לניתוח RNA וחלבון, ובכך לספק פרטים נוספים על פרוטאום של polysomes, זיהוי גורמים התורמים ברגולציה של תרגום.
לכן, פרופיל polysomal היא טכניקה צדדי ניתן להשתמש כדי לנתח את המדינה translational של mRNAs בודדים, לבדוק חלבונים הקשורים ריבוזום וללמוד תקנה translational אורגניזמים מודל שונה תחת שונות ניסיוני תנאים.

בקרת גנים בתאים נשלטת על ידי גנים ברמת השעתוק, posttranscriptional ו- posttranslational. ההתקדמות רצף הרנ א עמוק לאפשר המחקר של מצב יציב רמות ה-mRNA בקנה מידה הגנום כולו ברמה חסרת תקדים. עם זאת, הממצאים האחרונים גילה כי רמת ה-mRNA מצב יציב לא תמיד לתאם עם חלבון ייצור1,2. גורלו של התעתיק בודדים מורכב מאוד, תלוי בגורמים רבים כמו גירויים פנימי/חיצוני, הלחץ, וכו '. בקרת גנים במהלך סינתזת החלבון מספק שכבה נוספת של בקרת ביטוי הכרחי לתגובה מהירה בשינוי תנאי. Polysome (או "polyribosome") שימוש בפרופילים, את ההפרדה והדמיה של פעיל תרגום הריבוזומים, היא שיטה חזקה ללמוד ברגולציה של סינתזת החלבון. למרות, יישומים ניסיוני הראשון שלו הופיע של שנות ה-603, פרופיל polysome נחשב כיום לאחד הטכניקות החשובות חלבון תרגום מחקרים4. MRNAs יחיד יכול להיות מתורגם על ידי אחד או יותר ריבוזום שמוביל היווצרות polysome. תעתיקים יכול להיות התעכב על הריבוזומים עם cycloheximide5 ו mRNAs המכיל מספר שונה של polysomes ניתן להפריד בתהליך polysome fractionation על ידי סוכרוז הדרגתיות ultracentrifugation6,7 , 8 , 9. ניתוח RNA של שברים polysomal מכן מאפשרת מדידה של שינויים בארצות translational של הפרט mRNAs בקנה מידה הגנום כולו, ובמהלך מצבים פיזיולוגיים שונים4,7, 10. השיטה שימש גם כדי לחשוף את התפקידים של 5' UTR, 3' UTR רצפי הבקרה של ה-mRNA translatability11, לבחון את תפקיד miRNAs דיכוי translational12, שמתוכננות לגלות פגמים בריבוזום להן13 , ולהבין את התפקיד של הריבוזום-הקשורים חלבונים עם מחלות אנושיות14,15. במהלך העשור האחרון, תפקיד גדל והולך עבור בקרת גנים במהלך התרגום התפתחה הממחיש את חשיבותו של מחלות אנושיות. העדויות על בקרה translational ב סרטן, מטבוליות, מחלות ניווניות הוא המכריע15,16,17,18. לדוגמה, dysregulation של שליטה translational תלויי-eIF4E תורמת אוטיזם הקשורים גירעונות15 ו- FMRP מעורב השתהות של הריבוזומים על mRNAs קשורה לאוטיזם14. לפיכך, פרופיל polysomal הוא כלי מאוד חשוב ללמוד פגמים בתקנה translational מחלות אנושיות מרובות.
אנליזת חלבונים שברים polysomal בתנאים פיזיולוגיים שונים מבתר את הפונקציה של גורמים הקשורים הריבוזומים במהלך התרגום. הטכניקה פרופיל polysome שימש במינים רבים, לרבות שמרים בתרבית של תאים, צמחים, חד-תאיים10,19,20,21. טפילים protozoan כמו Trypanosoma ולישמניה להפגין שליטה מוגבלת תעתיק של ביטוי גנים. הגנום שלהם מאורגנות אשכולות גנים polycistronic חסרי שעתוק מקדם מוסדר22. במקום זאת, ביטוי גנים התפתחותית נשלטת בעיקר ברמה של חלבון תרגום ויציבות mRNA trypanosomatid מינים23,24. לכן, הבנה של שליטה translational בהעדר רגולציה תעתיק זה חשוב במיוחד עבור אורגניזמים אלה. פרופיל polysomal הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד posttranscriptional בקרת גנים לישמניה25,26,27,28.
התקדמות האחרונות בזיהוי של רמות mRNAs בודדים על-ידי אמת בפעם ה-PCR כמותי (RT-qPCR), transcriptome מלאה על ידי רצף הדור הבא, כמו גם טכנולוגיות פרוטאומיקס, מביא את הרזולוציה ואת היתרונות של פרופיל polysomal לרמה חדשה. השימוש בשיטות אלה ניתן להרחיב הלאה על ידי רצף הרנ א עמוק בשילוב עם ניתוח פרוטיאומיה מבנית כדי לפקח על מצב translational של תאים בקנה מידה הגנום כולו על ידי ניתוח של שברים polysomal בודדים. דבר זה מאפשר זיהוי שחקנים מולקולריים חדשים ויסות תרגום בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן, אנו מציגים polysome האוניברסלית של פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים: טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים, רקמות חיות. אנו מציגים את העצה על הכנת תא lysates אורגניזמים שונים, אופטימיזציה של תנאי מעבר צבע, הבחירה של מעכבי RNase ויישום של RT-qPCR, תספיג ו RNA אלקטרופורזה לנתח שברים polysome במחקר זה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>Piston Gradient Fractionator</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, class II, type A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco freezer</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultracentifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Swing-bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax software&amp;nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting slides, dual chamber for cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Surface plate, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; flasks</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL conical centrifuge tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion by Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium-high glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Ribosomal protein S6 (C-8) antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Lithium cloride</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Buffer II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Trichloracetic acid (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&#039;-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate sodium salt hydrate (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophoshatase</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis

ביטוי חלבון הנכון בזמן הנכון, בכמות הנכונה היא הבסיס של תאים נורמליים פונקציה והישרדות בסביבה המשתנים במהירות. במשך זמן רב, המחקרים ביטוי גנים נשלטו על ידי מחקר על רמת גנים ברמת השעתוק. עם זאת, רמות מצב יציב mRNAs לא מתאימות היטב עם ייצור החלבון, translatability של mRNAs משתנה מאוד בהתאם לתנאים. אורגניזמים מסוימים, כמו טפיל לישמניה, הביטוי חלבון מוסדר בעיקר ברמת translational. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו ש-dysregulation תרגום החלבון הזה מזוהה עם סרטן, חילוף החומרים, ניווניות מחלות אנושיות אחרות. פרופיל polysome היא שיטה חזקה ללמוד תקנה תרגום החלבון. זה מאפשר למדוד את מצב translational mRNAs בודדים או לבחון תרגום בקנה מידה הגנום כולו. הבסיס של טכניקה זו היא ההפרדה polysomes, ריבוזומים, שלהם subunits, mRNAs חינם במהלך צנטריפוגה של cytoplasmic lysate דרך מעבר הדרגתי סוכרוז. כאן, אנו מציגים polysome אוניברסלי פרופיל פרוטוקול המשמש על שלושה דגמים שונים - טפיל לישמניה הגדולות, בתרבית תאים אנושיים ורקמות חיות. לישמניה תאים לגדול באופן חופשי ההשעיה, בתרבית תאים אנושיים לגדול חסיד טפט, בעוד העכבר testis מייצג של דגימת רקמה חיה. לכן, השיטה היא מותאם לכל אחד ממקורות אלה. הפרוטוקול עבור הניתוח של שברים polysomal כולל זיהוי של רמות ה-mRNA בודדות מאת RT-qPCR, חלבונים על ידי תספיג וניתוח של RNAs ribosomal על ידי אלקטרופורזה. השיטה ניתן להרחיב הלאה על ידי לספקטרומטרית מסות של השברים על ידי בחינת mRNAs שיוך הריבוזום ברמת transcriptome על ידי RNA עמוק-seq וניתוח של חלבונים הקשורים ריבוזום. השיטה ניתן להתאים בקלות למודלים ביולוגיים אחרים.

במחקר זה, אנו מתארים את היישום של הטכניקה פרופיל polysomal על שלושה מקורות שונים: טפיל לישמניה הגדולותבתרבית תאים אנושיים, העכבר testis. לישמניה תאים לגדול באופן חופשי בתקשורת נוזלי ההשעיה, בתרבית תאים אנושיים לגדול טפט חסיד על צלחות ומייצג בזרמה העכבר דגימת רקמה. השיטה ניתן להתאים בקלות סוגים אחרים של תאים בוגרים בחופשיות ההשעיה, סוגים שונים של רקמות או אורגניזם אחר, סוגים שונים של תאים בתרבית. הגישה כוללת ארבעה שלבים עיקריים: הכנה lysate, הכנה הדרגתיות סוכרוז, שלב ultracentrifugation, polysome fractionation ופינוי מדגם ואחריו ניתוח של השברים. תאים ממקורות שונים שנאספו, שטופים lysed במאגר פירוק על ידי מעבר דרך מחט או דאונס מהמגן. צנטריפוגה משמש כדי להסיר שאריות תאים, ולהבהיר את lysate. התכנית של fractionation מעבר הצבע מוצג איור 1A. מעבר צבע רציף סוכרוז נוצר על ידי ערבוב של 10% ו 50% סוכרוז פתרונות ביוצר הדרגתיות. Lysate טעון על מעבר הצבע. Ultracentrifugation מפריד mRNAs הקשורים עם מספר שונה של הריבוזומים אשר נמצא בפיקוח גלאי UV במהלך fractionation, ויוצרים קשת ספיגת ברורים. שברים שנאספו משמשים לניתוח RNA וחלבון (איור 1B). RNA יכול להיות מנותח על ידי אלקטרופורזה ואחריו חשופה בצפון או המשמש לייצור cDNA ואחריו לתגובה RT-qPCR כדי לנתח את השיוך של הפרט mRNAs polysomes. הדור הבא רצפי יכול לשמש כדי לנתח את מצב translational mRNAs על הגנום כולו מידה7. לניתוח חלבון של שברים polysomal, חלבונים הם זירז עם חומצת חומץ טריכלור לרכז אותם. חלבונים הם מכן נותחו באמצעות ווסטרן סופג או לספקטרומטרית ברמת פרוטאום.
פרופיל polysomal טיפוסי המופקים לישמניה הגדולות באופן פעיל גדל תרבות מוצג באיור 2A. גרף ספיגת fractionation יש צורה ברורה עם טיפוסי פסגות ריבוזום subunits (40 ו-60), יחיד ריבוזומים (שנות ה-80 או monosomes), polysomes.
RT-PCR כמותי (RT-qPCR) הועסק כדי לזהות השיוך של הפרט mRNAs לישמניה הריבוזומים ו- polysomes. השיטה השוואתית של31 CT (ΔΔCT) היא בגישה המתאימה ופשוט ללמוד רמות היחסי mRNAs בתאים. שיטה זו דורשת של בקרה פנימית (יציבה mRNA, שאינו משתנה ביטוי במהלך טיפולים או תנאי הניסוי) עבור חישובים. עם זאת, יש שליטה פנימי שברים polysomal כי רמות של mRNA או ribosomal RNA ישתנו שברים, בהתאם שיוכן הריבוזומים, polysomes, וכו '. כדי לפתור את הבעיה של פקד פנימי, השתמשנו mRNA OmpA חיידקי סינתטי עבור נורמליזציה של רמות ה-mRNA לישמניה בודדים היחסי שברים. OmpA mRNA היה מסונתז במבחנה , להוסיף בכמויות שוות כל שבר לפני ה-RNA עקירות. תוספת של RNA סינתטי חשוב כי זה עושה חישובים של RT-qPCR נתונים מדויקים יותר, הגשה בקרה פנימית עבור חישובים בשיטה CT (ΔΔCT) השוואתי.
Aliquots של שברים הדרגתיות, מעורבים לשלוש קבוצות: prepolysomes (subunits ו- monosomes), אור polysomes (המורכב של הריבוזומים 2-4), polysomes כבד (המורכב של הריבוזומים 5-8). RT-qPCR בוצעה ב- RNA של שברים משולבים כדי לנתח את התפלגות mRNA בין אלה שברים משולבים (איור 2B). 18S ribosomal RNA שימש פקד. רמות היחסי שלה נקבע על ידי RT-qPCR בקורלציה עם חלוקת המשוערת subunits ribosomal קטן (יחידת משנה חינם, ולא כחלק monosomes ו- polysomes) על הספקטרום. ניתוח RT-qPCR גילה כי mRNAs בודדים נבדקו יש מידה שונה של אירוסין בתרגום במהלך שלב לוגריתמי לישמניה הצמיחה. טובולין mRNA משויכת מעדיפים polysomes כבד, המציעה תרגום יעיל. לעומת זאת, Sherp mRNA נמצא בעיקר עם prepolysomes ו- polysomes אור תומך תרגום פעילות פחות בהשוואה טובולין mRNA.
ביטוי של חומרים בתאים בתרבית הוא גישה נסיונית חשוב בקטגוריות שונות של מחקרים. כאן, אנו מציגים דוגמא מאפיינת polysomal של חלבון רקומביננטי mRNAs במקור מדגם אחר, בתרבית תאים אנושיים. הלה התאים היו transiently transfected עם פלסמידים רקומביננטי סיסטיק פיברוזיס מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)34 או חלבון מחלת Norrie (NDP). ספיגת ספקטרום של polysome fractionation של שתי תרבויות עצמאית אלה היו דומים מאוד ומצומצם פסגות ברורים המתאימים subunits 30s ריבוזומלי (40 ו-60), monosomes (שנות ה-80), polysomes (איור 3 א). הדמיון הספקטרום של ניסויים אלה ממחיש הפארמצבטית של fractionation מעבר הצבע. כמו במחקרים לישמניה , חלוקת mRNAs נקבע ע"י RT-qPCR שברים המייצגים prepolysomes polysomes אור, כבד polysomes (איור 3B). זיהוי של יחידת משנה ribosomal קטן 18S RNA בקורלציה עם פריסתם מוערך ב הספקטרום. נתפרש mRNAs היו בעיקר מזוהה עם שברים polysomal קל וכבד, בעוד CFTR mRNAs נמצאו בעיקר בחלקים prepolysome, רומז כי נתפרש מתורגם בצורה יעילה יותר. בעוד נתפרש הוא חלבון קטן יחסית, CFTR הוא חלבון גדול מאוד (1480 חומצת אמינו שאריות) המורכב מ במספר תחומים, כך מקפלים באופן עצמאי במהלך התרגום35. מחויבויות התחתון של ה-CFTR mRNA עם polysomes עשוי לשקף איטי התרגום הנדרש לקיפול cotranslational של תחומים ברורים שלה.
שברים polysome יכול לשמש גם לצורך זיהוי של חלבונים. זיהוי של חלבונים בחלקים הדרגתיות נערך על הדוגמה של חלבונים ribosomal בתאים הלה (איור 4). חלבונים רוכזו על ידי משקעים עם 10% TCA שברים, תספיג שימש כדי לזהות חלבונים ribosomal יחידת משנה קטנים RPS6 ויחידה משנית גדולה ribosomal חלבון RPL11 (איור 4, החלונית העליונה). פריסתם בקורלציה עם הפסגות ברורים מספקטרום ספיגת. ניסויים אלה מדגימים בבירור כי שברים polysome יכול לשמש כדי לנתח חלבונים בהם.
רבים סוכרוז שונות ריכוזי מעברי צבע (למשל, 7-47%36, 5-50%7, 7-50%6 , 10-50%37, 15-50%8ועוד) עבור polysomes fractionation שימשו. כאן, אנחנו לעומת שני מעברי צבע 10-50% ו- 17-51% (איור 5). למרות, 17-51% המיוצר תוצאות מתקבלות על הדעת, ההפרדה בין 10-50% מעבר הצבע היה הכוללת טוב יותר.
זה מתועד היטב כי סוכני chelating, כגון EDTA, לשבש את הריבוזומים, polysomes8,9. כפי שהיא מוצגת באיור 6, טיפול EDTA הלה lysate לפני טעינה במעבר הצבע מוביל היעלמותו של הפסגות, המתאים monosomes, polysomes, עלייה משמעותית subunits ריבוזום פסגות. הניסוי הזה שימש פקד והפגינו כי הפסגות שנצפה ללא טיפול EDTA הם למעשה ribosomal monosomes polysomes.
איור 7 מראה תוצאות של polysome fractionation מן האשכים העכבר. ספיגת הספקטרום יש קווי דמיון עם אלה מתאי לישמניה , הלה: פסגות ברורים ribosomal subunits, monosomes, polysomes. הצורה וההפצה שלהם לייצר מראה חתימה, זה עושה את זה קל לזהות אותם על ספקטרום polysomal שונה. RNAs סה כ היו טהור מפני השברים, RNAs מפני שברים שנבחר נותחו על ידי אלקטרופורזה ב agarose ג'ל (איור 7, החלונית העליונה). אלקטרופורזה מראה אופייני חלוקת RNAs ribosomal 18S, 28S. להקות חדה שלהם מצביעים על intactness של הדגימות. הג'ל עשוי לשמש לזיהוי mRNAs בודדים על ידי אבן חשופה הצפוני הבא או זה יכול לשמש כדי להעריך את איכות של הדגימות לפני לניסויים נוספים על ה-RNA חלבון או ניתוח - RNAs ribosomal כשמאירים להקות לציין RNA השפלה הדגימות.
במהלך הלימודים שלנו, השתמשנו RNase מעכב, הפארין בתור RNase מעכבי ב lysates וסוכרוז מעברי הצבע. בעוד שניהם תוצאות משביעות רצון, השימוש RNase מעכב היה עדיף לניתוח RNA כי זה לא לעכב את cDNA RT-qPCR תגובות. לכן, זה לא מחייבים צעדים נוספים של טיהור RNA. עם זאת, אם חוקרים מחליט להשתמש הפרין במהלך הכנת polysome, להיות מודע לכך הפארין מעכב למטה-stream יישומים כגון RT-qPCR צעד נוסף של טיהור RNA נדרש (ראה פרוטוקול סעיף 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig1.jpg"> איור 1 . פרופיל polysome. (א) ערכת הכנה הדרגתיות, polysome fractionation ו ספיגת פרופיל. סכימת (B) של ניתוח שבר. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig2.jpg"> איור 2 . ניתוח הפרופיל polysome לישמניה הגדולות תרבות לוגריתמי בשלב של צמיחה. (א) Cytoplasmic lysate היה fractionated 10-50% סוכרוז הצבע. (B) הפצה היחסי של 18S RNA, טובולין, Sherp mRNAs (%) ב- prepolysomes, polysomes קל וכבד של תאים יומן נותחו על ידי RT-qPCR. שברים המכיל בשנות ה-40, בשנות ה-60, monosomes היו משולבות כמו prepolysomes. שברים עם 2-4 הריבוזומים משולב כמו אור polysomes, בעוד שברים עם 5-8 הריבוזומים נוצר polysomes כבד. סינתטי e. coli OmpA mRNA להוסיף שברים החילוץ-RNA מוקדמת שימש פקד נורמליזציה ב RT-qPCR. השוואתי CT (ΔΔCT)31 לשיטה ששימשה לחישוב של רמות ה-mRNA. קווי שגיאה מייצגים תקן שגיאות. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig3.jpg"> איור 3 . Polysome fractionation וניתוח של recombinant CFTR ולא נתפרש mRNAs שיוך הריבוזומים בתאי הלה transfected עם פלסמיד DNAs. (א) פרופיל Polysomal בתאים הלה transfected עם פלסמידים CFTR ולא נתפרש. 10% - 50% סוכרוז הדרגתי הוחל על מנת להשיג הפרדת polysomes. הפסגות קטן (40) subunits גדולים (60), כמו גם monosome (80) מסומנים. שברים היו משולבות כפי שמוצג על פאנל A וישמשו לצורך ניתוח נוסף. (B) חלוקת mRNAs CFTR, נתפרש בחלקים שונים. זיהוי של 18S מאת RT-qPCR שימש פקד polysome fractionation. רמות ה-RNA הוערכו על ידי ניתוח RT-qPCR. הנתונים היו מנורמל באמצעות ה-mRNA סינתטי. השוואתי CT (ΔΔCT)31 לשיטה ששימשה לחישוב של רמות ה-mRNA. קווי שגיאה מייצגים תקן שגיאות. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig4.jpg"> איור 4 . זיהוי של חלבונים ribosomal הלה שברים polysomal. הלה תא lysate היה נתון על ידי 10% - 50% סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות. חלבונים בחלקים שנבחרו היו זירז עם TCA, נותחו על ידי אלקטרופורזה ב- 12% מרחביות-דף עם בעקבות המערבי סופג באמצעות העכבר monoclonal RPS6, ארנב נוגדן RPL11 polyclonal נוגדנים העיקרי, Peroxidase-Conjugated עז אנטי עכבר או ארנב נגד נוגדנים משניים. ויזואליזציה של אותות נעשה על ידי המצע chemiluminescent SuperSignal מערב פיקו פלוס. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig5.jpg"> איור 5 . השוואה של הלה polysomal פרופיל ב 10% - 50% (שחור) או 17%-% 51 (אפור) סוכרוז מעברי צבע. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig6.jpg"> איור 6 . השפעת הטיפול EDTA בפרופיל polysomal בתאים הלה. הלה תא lysate טופלה עם 10 מ מ EDTA על קרח למשך 10 דקות מיד לפני צנטריפוגה הדרגתיות סוכרוז. MgCl2 היה מוחלף על ידי 5 מ מ EDTA בפתרונות הדרגתיות סוכרוז. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57600/57600fig7.jpg"> איור 7 . פרופיל polysomal מרקמות testis העכבר lysate. שברים נתון החילוץ-RNA עם ריאגנט טיהור RNA, נותחו על ידי אלקטרופורזה ב 1% agarose ג'ל. <a href="/files/ftp_upload/57600/57600fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הבמה</td>
			<td>שלב</td>
			<td>תנאי</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">. תחזיק</td>
			<td rowspan="2">שלב 1</td>
			<td>מעלה את הטמפרטורה של 25 עד 50 מעלות צלזיוס עם 1.6° C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>דגירה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2:00 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">שלב 2</td>
			<td>מעלה את הטמפרטורה מ-50 עד 95° C עם 1.6° C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>דגירה ב 95° C עבור 10:00 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">ה-PCR</td>
			<td>שלב 1</td>
			<td>תקופת דגירה ב 95° C של 00:15 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">שלב 2</td>
			<td>להוריד את הטמפרטורה של 95 עד 60° צלזיוס עם 1.6° C /</td>
		</tr>
<tr>
<td>דגירה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1:00 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">מספר מחזורי 40</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">להמיס עקומה</td>
			<td>שלב 1</td>
			<td>מעלה את הטמפרטורה של 60 עד 95° C עם 1.6° C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">שלב 2</td>
			<td>להוריד את הטמפרטורה של 95 עד 60° צלזיוס עם 1.6° C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>דגירה ב 60 מעלות צלזיוס למשך 1:00 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">שלב 3 (דיסוציאציה)</td>
			<td>מעלה את הטמפרטורה של 60 עד 95° C עם 0.05° C/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>תקופת דגירה ב 95° C של 00:15 דקות</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. תנאים RT-qPCR

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis at JoVE.com

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

18.0K Views.  Texas Tech University Health Sciences Center. המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Video: Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Immunology and Infection

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people worldwide. Infection with L. donovani can result in fatal visceral disease. In Panama, Colombia, and Costa Rica, L. panamensis is responsible for most of the reported cases of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Studying a large number of drug candidates with the methodologies available to date is quite difficult, given that they are very laborious for evaluating the activity of compounds against intracellular forms of the parasite or for performing in vivo assays. In this work, we describe the generation of L. panamensis and L. donovani strains with constitutive expression of the gene that encodes for an enhanced green fluorescent protein (eGFP) integrated into the locus that encodes for 18S rRNA (ssu). The gene encoding eGFP was obtained from a commercial vector and amplified by polymerase chain reaction (PCR) to enrich it and add restriction sites for the BglII and KpnI enzymes. The eGFP amplicon was isolated by agarose gel purification, digested with the enzymes BglII and KpnI, and ligated into the Leishmania expression vector pLEXSY-sat2.1 previously digested with the same set of enzymes. The expression vector with the cloned gene was propagated in E. coli, purified, and the presence of the insert was verified by colony PCR. The purified plasmid was linearized and used to transfect L. donovani and L. panamensis parasites. The integration of the gene was verified by PCR. The expression of the eGFP gene was evaluated by flow cytometry. Fluorescent parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity were selected using flow cytometry.

Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP

Here, we describe the methodology used for generating L. panamensis and L. donovani strains expressing the gene for eGFP as a stable integrated transgene using the pLEXSY system. Transfected parasites were cloned by limiting dilution, and clones with the highest fluorescence intensity in both species were selected for further use in drug screening assays.

התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

Protozoan parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a disease with variable clinical manifestations that affects millions of people ...

Genetics

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Developmental Biology

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.

חקירת הפאגוציטוזה של לישמניה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Biology

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell types. This balance is tightly controlled by gene expression that is fine-tuned at multiple levels, including transcription, post-transcription and translation. In this regard, a growing body of evidence highlights a critical role of translational regulation in coordinating neural stem cell fate decisions. Polysome fractionation is a powerful tool for the assessment of mRNA translational status at both global and individual gene levels. Here, we present an in-house polysome profiling pipeline to assess translational efficiency in cells from the developing mouse cerebral cortex. We describe the protocols for sucrose gradient preparation, tissue lysis, ultracentrifugation and fractionation-based analysis of mRNA translational status.

The development of the mammalian brain requires proper control of gene expression at the level of translation. Here, we describe a polysome profiling system with an easy-to-assemble sucrose gradient-making and fractionation platform to assess the translational status of mRNAs in the developing brain.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Neuroscience

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...