עבודה זו נתמכה על ידי מענק של התוכנית מחקר מונסנטו ידע Rootworm תירס, מעניק מספר AG/1005 (ל MDL, שיקו לוי) וקרנות סטארט-אפ ל MDL מן NCSU. FC נתמכה על ידי מענקים של מונסנטו תירס Rootworm ידע תכנית המחקר (AG/1005), הקרן הלאומית למדע, להעניק מספר MCB-1244772 (MDL). המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים. FC ו- MDL נוצר ועוצב הניסויים; FC, PW ו- SP לבצע את הניסויים; FC ו- MDL ניתח את התוצאות; FC, נג ו- MDL כתב היד. אנו מודים תרזה אולירי, ויליאם Klobasa, סטפני גורסקי על סיוע מומחה שלהם הקרנה WCR. אנו מודים גם ד ר צרפתי וייד (USDA-ARS, צפון מעבדת המחקר החקלאי המרכזי, ברוקינגס, SD) עבור משלוחים ביצים להקים מושבות מעבדה, מתן פרוטוקולי גידול.

1. המושבה ברמת לגידול של מבוגרים WCR
<ol><li>בכמות ובאיכות של מבוגרים WCR (500-1000) ממעבדת החברה או מחקר אמין (ראו טבלה של חומרים לדוגמה) ומניחים בתוך כלוב3 30 ס מ. הערה: השימוש זן הלא-diapausing מומלץ בחום.</li>
	<li>הכנת מזון מלאכותי WCR ע פ הפרוטוקול של היצרן ויוצקים שכבה בעובי של ס מ 1 לתוך מיכל עוז 38 (ראה טבלה של חומרים). לאחר ערבוב, לאחסן דיאטה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	<li>לשים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם דיאטה למבוגרים (10-15 גרם) לתוך כלוב3 30 ס מ. הוסף עוד דיאטה כאשר המזון הוא נמוך או יבש.</li>
	<li>לשים בקבוקון (300 מ ל) עם מים, מכוסה עם כדור צמר גפן, אשר משמש כדי להחזיק במקום גליל כותנה (6 "x" 3/8), כדי לשמש כמקור מים. להחליף את המים כאשר הוא פועל נמוכה.</li>
	<li>לשמור על WCR בטמפרטורה 26 ° C עם 60% לחות, מחזור 14:10 אור חרק חממה לגידול.</li>
</ol>2. העובר אוסף ויישור
<ol><li>להפוך תא איסוף ביצים באמצעות אגר 1% במים סטריליים 100 x 15 מ"מ2 פטרי. לאחסן ב 4 ° C לאחר עפור אגר.</li>
	<li>לאסוף ביצים הניח שזה עתה, מניחים שכבה אחת של נייר סינון, ואחריו 4 שכבות של גזה (כל חתך לגודל) על פני השטח של אגר (איור 1 א'). הערה: גזה הניתנים לשימוש חוזר, לאחר שטף של אקונומיקה, בלוק, אבל זה לא הכרחי כדי לעשות את זה עבור השימוש הראשון. נייר סינון לא חוזר, אינו צריך להיות מעוקר.</li>
	<li>מניחים ביצה וספרייט לכלוב WCR מאוחר ביום ככל האפשר (בסוף יום העבודה) ולכסות עם אוהל נייר כסף. להשאיר למשך הלילה. הערה: נתקל האורות השעות 10:00 לביצה עיכובים 12 בבוקר (14 h) הנחת, למוצא האוסף של הצעיר ביצים עבור microinjection ללא צורך אנשי המעבדה למקם את האוסף קאמרית כלוב מאוחר בלילה.</li>
	<li>להסיר תא איסוף ביצים בסביבות 8 או 9 בבוקר</li>
	<li>להשתמש מלקחיים לאסוף שכבה 1 של גזה זמן ומקום ב גביע (500 מ"ל) מים. לשטוף ביצים ממני אריג מרושת על ידי בעדינות ערבוב (איור 1B וג 1).</li>
	<li>להשתמש על פיפטה הנורה כדי להעביר ביצים עוד גביע (500 מ"ל) מים. חזור על x 2-3 כדי לנקות את הביצים.</li>
	<li>להשתמש את הנורה פיפטה להעביר ביצים על גבי נייר סינון (איור 1D) תוך צמצום כמות המים carry-over.</li>
	<li>חתוך שחור מסנן נייר לרצועות רחב כמו שקופיות זכוכית ואת הסרט בחוזקה אל השקופית כדי לוודא הנייר מניח שטוח (איור 2 א). הערה: נייר סינון שחור מסייע לשפר את הראות תחת המיקרוסקופ על-ידי הפחתת כמות האור המוחזר.</li>
	<li>החלת דבק רעיל (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ) על נייר הסינון של קווים עדינים (איור 2B). שמור את הקווים דבק דק יותר הקוטר של ביצה. כדי להימנע מקבלת את הביצים מצופה דבק.</li>
	<li>השתמש במברשת בסדר כדי להניע בעדינות WCR ביצים אחת של נייר סינון שלהם לקו דבק. נסו להניח את הביצים על הדבק לפני וזה מייבש ולשמור על ביצה אחת לפחות של המרחק בין כל ביצה.</li>
	<li>למקסם יעילות הזרקת על ידי הצבת מספר שורות של ביצים בשקופית אחת נייר סינון (איור 3).</li>
	<li>לאחר כל הביצים נפרסות על נייר הסינון, המתן עד כל שהדבק מתייבש לפני microinjection. הערה: שינוי germline ולקבלת הגנום CRISPR/Cas9-מתווכת, עריכה, להזריק כל העוברים עד הצהריים (12 P.M.) כך העובר הבכור הוא בן יותר מ- 19 h. עם זאת, עבור RNAi, יש ללא מגבלה של זמן, כי ב- WCR, dsRNA יכול לעבור בין תאים. למעשה, עבור RNAi, העוברים יישון עשוי להתבטא טוב יותר שיעורי ההישרדות.</li>
</ol>3. הכנת פלסמיד DNAs, מחטים הזרקת
<ol><li>להכין דנ א פלסמיד supercoiled באיכות גבוהה תוך שימוש מסחרי ללא אנדוטוקסין קיט (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ).</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון הזרקה, לבדוק את ריכוז כל פלסמיד ולאחר מכן לשלב המסייע פלסמיד (250 ריכוז סופי ng/µL), תורם פלסמיד (750 ריכוז סופי ng/µL), מאגר פנול אדום (ריכוז סופי של 20%). מערבולת הפתרון בקצרה, צנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות המרבית, כדי לזרז חלקיקים יכול לסתום את המחט.</li>
	<li>משוך זכוכית בורוסיליקט מחטים (יתר 1 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ, 10 ס מ אורך) באמצעות פולר micropipette סוג של חום/הבוערים. לאחסון, לאבטח מחטים משך דו-צדדית קלטת דביק צלחת פטרי או אחרים מיכל ברורה. הערה: עבור מערכת פולר micropipette, ההגדרות המשמשות היו: חום = 335, FIL = 4, ול = 40, דל = 200, דופק = 100.</li>
	<li>מילוי המחט הזרקת באמצעות מיקרו-העובדים עצה (ראה טבלה של חומרים) כדי pipet 0.5 - 1.0 µL למטה בתוך המחט, ליד הקצה מחודדות. הסר בועות קצה המחט אם כל להתרחש.</li>
	<li>הכנס את המחט הזרקה בעל מחט.</li>
	<li>פתח את קצה המחט על-ידי שבירת בעדינות עם זוג נאה מלקחיים, או בעדינות לגעת/גרירת הקצה בשקופית coverslip או זכוכית. הערה: המטרה היא המזח הקטן ביותר שמאפשר את התמהיל הזרקת לצאת החוצה (פתחים קטנים יותר בדרך כלל דורשות הזרקה בלחץ גבוה יותר). מחטים משופעים ואינם דורשים שלב זה מאז הם כבר פתוחים.</li>
</ol>4. microinjection והטיפול שלאחר הזרקה
<ol><li>שימוש במכחול בסדר, בזהירות רטוב המשטח של 1-3 ביצים עם מים סטריליים את המחט, להזריק את הפתרון. להזריק כל ביצה לפני השטח מתייבש. חפשו את המראה כמות קטנה של צבע אדום בתוך ביצים במהלך ההזרקה כדי לציין את microinjection מוצלח. לרסק או להסיר את כל הביצים נראה פגוע, ריק, או אחרת לא יכול להיות מוזרק. הערה: למרות הזרקה בלחץ משתנה בהתבסס על גודל נשא מחט, 10-13 psi הוא נקודת התחלה טובה.</li>
	<li>לאחר כל הביצים מוזרקים, להסיר את נייר סינון השקופית זכוכית.</li>
	<li>מניחים נייר הסינון על פני השטח של צלחת אגר 1% (המתואר לעיל).</li>
	<li>השתמש פרפין פלסטיק הסרט החותם את המנה, ותשים חרק 26 ° C לגידול חממה במשך 12 יום. הערה: הסרט פרפין תסייע למנוע זיהום עובש בין הצלחות. עם זאת, כל טיפול אחר למניעת התפתחות חיידקים ולעצב יכול להפחית את ההישרדות של העוברים מוזרק.</li>
</ol>5. culturing וגדלים של עוברי
<ol><li>הפעלת בדיקת העוברים 12 ימים שלאחר הזרקת עבור הזחלים שזה עתה בקעו ולהמשיך מדי יום במשך השבועיים.</li>
	<li>להעביר את הזחלים, בעזרת מברשת בסדר, לתיבת rearing עם נבט התירס ואדמה. הערה: עובש יכול לגדול לתוך המנה אגר, אך הזחלים יבקעו עדיין ברוב המקרים. חפשו את הזחלים בזהירות בתוך כייר לתפוס את כולם. הזחלים קצת אולי להעביר המכסה של המנה, אולי נתקע עיבוי.</li>
	<li>אחורי הזחלים בטמפרטורה 26 ° C בעקבות תקן WCR לגידול בשיטות25.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות microinjection של WCR עם dsRNAs לצורך RNAi כבר דווח על9, זהו הפרוטוקול הראשון להקים מומלצות microinjecting precellular WCR עוברי, תהליך קריטי עבור ניצוח germline שינוי ו/או הגנום CRISPR/Cas9 עריכה של מין זה. Microinjection מוצלחת של WCR עוברי הוא תלוי בגורמים רבים, וכן יעילות טרנספורמציה. בהמשך הם בחלק מן הנושאים העיק...

תירס המערבית rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, היא הדברה חשובים של תירס1. מעניין, WCR מופיע כדי להתגבר על שליטה מודד במהירות רבה יותר מאשר מזיקים החקלאי ביותר מאז הם לא רק להתאים מבחינה פיזיולוגית, אלא גם בהתנהגותו2,3,4,5, 6. בעשור האחרון, RNA הפרעה (RNAi), כלי רב-עוצמה פונקציונלי גנומית נחקר כשיטה בקרה פוטנציאליים עבור7,WCR8, ו גם שימש כאמצעי ללמוד ג'ין פונקציה9. אולם, בעוד RNAi מבוצע לעתים קרובות על ידי microinjection של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) בחיות אחרות, מבוססת על הזרקת RNAi הוא נדיר WCR. למעשה, ישנם רק כמה דיווחים של RNAi באמצעות microinjection של dsRNA לתוך WCR9. הסיבה היא כי WCR יכולים להשיג גבוהה-רמות של ג'ין תמונות ציפורים באמצעות בליעה של dsRNA7,10, אפילו המתיר את חקר תופעות עובריים מאכילים dsRNA אמא11. בעוד ששיטה זו עושה WCR נושא מצוין עבור אנליזה גנומית פונקציונלית ויה RNAi, זה הואטה ההתקדמות על פיתוח מתודולוגיות עובריים microinjection במין זה.
למרות כוחו של RNAi, ישנם כמה חסרונות. לדוגמה, לא כל הגנים להגיב באותה מידה RNAi. ההשתנות יכול להפוך לפרש את התוצאות של לסיבי assay קשה יותר. בנוסף, RNAi הוא חולף, אינו יוצר מוטציות heritable. מצד שני, germline טרנספורמציה, עוד כלי גנומית תפקודית, ניתן ליצור מוטציות heritable באמצעות החדרת טרנספוזון מסומן לתוך הגנום12,13. זה עושה את השינוי germline כלי מצוין ליצירת זנים מוטציה לשימוש במחקרים גנטיים לטווח ארוך. השינוי יכול לשמש גם כדי להציל מוטציה על ידי מסירת עותק פונקציונלי של הגן הגנום מוטציה14. יתר על כן, השינוי germline היא אבן הפינה של מגוון רחב של טכניקות גנטיות מולקולריות. בנוסף לדפוק ו/או הצלת תפקוד הגן, טרנספורמציה germline יכול לשמש משפר השמנה15, ג'ין השמנה16, המבוסס על Gal4 ביטוי חוץ רחמי17של הגנום כולו מוטגנזה מכוונת18.
לאחרונה, פותחו כלים המאפשרים עריכה מתוחכמת הגנום. כלים אלה כוללים שעתוק Activator-Like אפקטור Nucleases (TALEN), CRISPR/Cas9-נוקלאז מערכת19,20. היתרון של כלים חדשים אלה הוא בכך שהם מציעים החוקרים את היכולת לגרום להפסקה DNA גדילי כפול כמעט בכל מקום בתוך כמעט בכל הגנום. ברגע המושרה, הפסקות אלה ניתן לתקן באמצעות אחד מהקצוות שאינם הומולוגיים הצטרפות, אשר יכול להציג מחיקות או הוספות בגן יישוב, או באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה, אשר בנוכחות לבנות מהונדסים, יכולים לעודד החלפה של גנים כולו או אזורים גנטיים21,22. עם זאת, שיטות אלה דורשים microinjection של ה-DNA, RNA או החלבון לתוך עוברי צעיר מאוד.
חשוב, בניגוד dsRNAs המשמש RNAi, חומצות גרעין וחלבונים המשמשים germline שינוי ועריכה הגנום לא יכול בקלות לחצות קרום התא. לכן, microinjection של פלסמיד DNAs, mRNAs, ו/או חלבונים חייב להתבצע במהלך השלב syncytial blastoderm (דהיינו לפני העובר חרקים cellularizes). זה הופך התזמון של זריקות גורם קריטי. לדוגמה, ב- דרוזופילה melanogaster, העוברים צריך להיות מוזרק בתוך שעתיים אחרי ביצה שכבה12. לפיכך, פיתוח פרוטוקול microinjection עובריים מוצלח עבור WCR חייב לקחת בחשבון את התנאים הטובים ביותר להטלת הביצית, כמו גם השיטה הטובה ביותר לאיסוף כמויות מספיקות של עוברי precellular.
מאמץ להביא מגוון רחב של כלים גנטיים על ביולוגיה WCR דורש פיתוח שיטות איסוף של microinjecting precellular WCR עוברי. כאן אנו מספקים הוראות מפורטות, יחד עם טיפים וטריקים, לעזור לאחרים להשתמש בטכניקות מבוססות-טרנספורמציה במחקר WCR. ומאריכים הטרנסגניים טכנולוגיות כדי WCR לשימוש פונקציונלי גנומית מחקרים, טכניקות אלו מאפשרים גם עוצמה אסטרטגיות שליטה חדשות המזיק כגון גנים נסיעה23,24 ייבדק בזה כלכלית המזיק.

<table><tbody><tr><td>Qualitative Filter Paper (Black)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>For egg microinjection</td></tr><tr><td>1 oz Containers&amp;nbsp;</td><td>Anny&#039;s Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Egg container</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrate for WCR egg-laying dish</td></tr><tr><td>Featherweight Forceps&amp;nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Handling larvae and pupae&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Wash corn and dishes</td></tr><tr><td>Trucker&#039;s Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Corn for feeding WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (Homemade)</td><td>NA</td><td>Parts &amp;amp; instructions available upon request</td><td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer&#039;s Non-toxic Glue</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Glue eggs on filter paper</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Backfilling needle loading tips</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Wash dishes</td></tr><tr><td>Plain Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td><td>Frontier Agricultural Sciences&amp;nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR adult artificial diet</td></tr><tr><td>Cotton Balls, Large</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Close the flask</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Collect and transfer eggs</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&amp;nbsp;</td><td>WCR screening</td></tr><tr><td>DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Excitation filter: 440&amp;ndash;520 nm, emission filter: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Cage for adult colony</td></tr><tr><td>Miniature Paint Brush</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulator and needle holder</td></tr><tr><td>Microscope XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>For egg-lay</td></tr><tr><td>Plastic paraffin film&amp;nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Incubator</td><td>Percival&amp;nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td></tr><tr><td>Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Water container for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Beakers</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>For egg wash</td></tr><tr><td>Braided Cotton Rolls</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Use in water supply for adult colony&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>For diet plates</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Microinjection buffer</td></tr><tr><td>Laser-based Micropipiette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Topsoil</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Soil for cron growing</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR single pair mating chamber&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Containers</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larvae rearing box/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larvae rearing box/16 oz</td></tr><tr><td>Microinjection Scope&amp;nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Microinjection scope outfited with an XY stage</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Microinjection needles</td></tr><tr><td>Adult Western Corn Rootworms</td><td>North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td><td>Non-diapase strain</td><td>Request from Dr. Bryan Wade French&#039;s lab</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td></tr></tbody></table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

Rootworm תירס המערבי (WCR) המזיק חשוב של תירס והיא ידועה בשל יכולתו להסתגל במהירות אסטרטגיות ניהול בפשט. למרות התערבות ב RNA (RNAi) הוכיח להיות כלי רב עוצמה עבור לימוד הביולוגיה WCR, יש המגבלות. באופן ספציפי, RNAi עצמו הוא חולף (כלומר לא תגרום לטווח ארוך התורשה של פנוטיפ המשויך), וזה דורש לדעת את רצף ה-DNA של הגן היעד. האחרון יכול להיות הגבלת אם פנוטיפ עניין נשלטת על ידי גנים שנשמרת לקוי, או אפילו רומן, כי זיהוי מטרות שימושי להיות מאתגר, אם לא בלתי אפשרי. לכן, מספר כלים בארגז גנומית של WCR צריך ניתן להרחיב באמצעות פיתוח שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור זנים מוטציה יציב ולאפשר סקרים עצמאית רצף הגנום WCR. במסמך זה, אנחנו פירוט האמצעים שננקטו כדי לאסוף microinject precellular WCR עוברי עם חומצות גרעין. בעוד הפרוטוקולים המתוארים בזאת מכוונים היצירה של WCR מהונדס, עריכה CRISPR/Cas9-הגנום יכול גם להתבצע תוך שימוש באותם הפרוטוקולים, כאשר ההבדל היחיד הוא ההרכב של הפתרון מוזרק העוברים.

שיקול חשוב בעת פיתוח פרוטוקול זה היה השלב של התפתחות בזמנו של microinjection. באופן ספציפי, טרנספורמציה germline דורש microinjection של DNAs לפני cellularization עובריים. זה בגלל DNAs לא יכול בקלות לחצות את קרום התא. ניסיונות כדי להמחיש את שלבי ההתפתחות עובריים WCR בעזרת כתם גרעיני היו לא מוצלח כי dechoriona...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

7.4K Views.  North Carolina State University. כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Video: Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetics

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Behavior

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Developmental Biology

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...