פרוטוקול זה מאפשר הערכה בזמן אמת של תהליכים שונים ופרמטרים ביוכימיים בתוך לומן של מקרופאינום בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש לגילוי סמים בביולוגיה התאית של מקרופינוציטוזיס. פרוטוקול זה מספק את היתרון של חשיפת הטרוגניות הן ברמת התא והן ברמת האברונים.
יום אחד לפני הזרעים Raw264.7 תאים בצפיפות של חמש פעמים 10 לכוח של התאים ב 100 microliters לבאר, בצלחת 96-באר תחתון זכוכית עם צדדים שחורים. ביום הבדיקה בדוק אם בארות הם לפחות 70% מפגש. לאחר מכן לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS, מתוכנן מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ו 0.025 מיליגרם של פלואורסצין שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן בכל באר, ולאחר מכן לדגור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הדגירה הושלמה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור לשטוף את התאים שש פעמים עם 100 microliters של HBSS. לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 100 microliters של HBSS מחמם מראש לתאים ואז למקם את הצלחת על מיקרוסקופ עם במה מחוממת ותא.
לאחר התאמת הפרמטרים עירור ופליטה עבור TMR ופלואורסצין לפי הצורך, לרכוש תמונה מכל באר לסירוגין בין שני פלואורופורים בין כל באר. לאחר הרכישה הראשונה, בדוק אם כל הבארות נשארו בפוקוס על פני הצלחת כולה, ולאחר מכן לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות למשך הזמן הרצוי. במהלך רכישת התמונה, להתאים את ה- pH של 50 מיליליטר aliquot של תמיסה עשירה באשלגן חוצץ עם HEPES 25 מילימולרי ל 7.5 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית טוחנת, או 10 אשלגן הידרוקסיד טוחנת לפי הצורך.
לאחר מכן להתאים את ה- pH של 350 מיליליטר aliquots של פתרון עשיר באשלגן חוצץ עם 25 מילימולר MES ל pH 6.5, pH 5.5 ו- pH 5.0. לאחר השלמת רכישת התמונה, הסר את HBSS מהצלחת 96-well המכילה את התאים והוסף את הפתרון העשיר באשלגן ב- pH 7.5. לאחר מכן להוסיף ניז'ריצ'רין בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר.
הנח את הצלחת בחזרה על המיקרוסקופ ולרכוש תמונות של כל באר באמצעות אותן הגדרות רכישה כפי שהוכח בעבר. כדי למדוד אירועים חמצוניים בתוך macropinosomes, זרע RAW264.7 תאים בצלחת 96 באר יום אחד לפני ההסתה כפי שהוכח בעבר. ואז ביום של אסאי לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS מראש מחמם ל 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ו 0.025 מיליגרם למיליליטר של H2DCFDA שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן לכל באר, ולאחר מכן לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הסרת הצלחת מן האינקובטור לשטוף את התאים שש פעמים עם 100 microliters של HBSS. לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 100 microliters של HBSS לכל באר ומניחים את הצלחת על המיקרוסקופ.
לאחר התאמת פרמטרי העירור והפליטה עבור TMR ו- H2DCFDA לפי הצורך, לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות כפי שהודגם בעבר. כדי למדוד עיכול חלבונים בתוך מקרופאינוזומים, זרע RAW264.7 תאים יום אחד לפני ההסתה, כפי שהוכח בעבר. ואז ביום של בדיקות לשטוף את כל בארות עם 100 microliters של HBSS מראש מתוכנן מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
הבא להוסיף 100 microliters של HBSS המכיל 0.025 מיליגרם למיליליטר של TMR שכותרתו 70 קילודלטון דקסטרן ב 0.2 מיליגרם למיליליטר BODIPY שכותרתו אלילבומין לכל באר. ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר הסרת התאים מן האינקובטור, לשטוף אותם שש פעמים עם 100 microliters של HBSS.
לאחר הכביסה האחרונה להוסיף 100 microliters של HBSS לכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת על המיקרוסקופ. לאחר התאמת פרמטרי העירור והפליטה עבור TMR ו- BODIPY לפי הצורך, לרכוש תמונות של כל באר במרווחים של דקה עד 15 דקות כפי שהודגם בעבר. בעת מדידת ה- pH, אירועים חמצוניים או השפלת חלבונים במקרופינוזומים, לא ניתן למדוד את הדינמיקה של החמצה לפרק זמן מסוים המתאים לשלב הטעינה של דקסטרן, המשתנה בהתאם לסוג התא בו נעשה שימוש.
בעת מדידת ה- pH של המקרופאינום, יחס הפלואורסין ל- TMR יהפוך בהדרגה לקטן יותר ויתייצב בתוך 15 דקות הרכישה. רמה זו תואמת pH של כחמישה, אשר בערך תואם את ה- pH של ליזוזומים. בסוף כל רכישה, כיול In situ מבוצע.
יחס הפלואורסין ל- TMR צריך להיות הגדול ביותר בתוך מאגר הכיול ב- pH 7.5 ולהיות קטן יותר בהדרגה ככל שמאגרי הכיול הופכים לחומציים יותר. זה מאפשר יצירת עקומת כיול. בעת מדידת אירועים חמצוניים בתוך macropinosomes, היחס בין H2DCFDA ל- TMR יהיה גדול יותר בהדרגה וסביר להניח רמה בתוך 20 עד 30 הדקות הראשונות בתאי RAW264.7 מופעלים.
בעת מדידת עיכול חלבון macropinosomal, אות פלואורסצ'ין חזק בהדרגה ישוחרר כמו הסגלגל מתעכל. בתאי RAW264.7, העלייה בפלואורסצנטיות המשתחררת מה- Ovalbumin המעוכל של BODIPY, תעלה בתוך 30 הדקות הראשונות. עם התפקיד המתהווה הזה בהומיאוסטזיס וזה רלוונטי לאחרונה לפתולוגיה של סרטן, מחקר מקרופינוציטוזיס רנסנס נמצא בעיצומו.
שיטות אלה מסופקות לארגז כלים לבחינת תרומתו של מקרופינוציטוזיס לתחומי מחקר אלה.
