Este protocolo permite a avaliação em tempo real de vários processos e parâmetros bioquímicos dentro do lúmen de macropinossos individuais. Esses métodos podem ser empregados para a descoberta de drogas na biologia celular da macropinocise. Este protocolo oferece a vantagem de revelar a heterogeneidade tanto no nível celular quanto na organela.
Um dia antes do ensaio semente Raw264.7 células a uma densidade de cinco vezes 10 para o poder das células em 100 microliters por poço, em uma placa de fundo de vidro 96-bem com lados pretos. No dia do ensaio verifique se os poços são pelo menos 70% confluentes. Em seguida, lave todos os poços com 100 microliters de HBSS, pré-armados a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulados 70 kilodalton dextran e 0,025 miligramas por mililitro de fluoresceína rotulado 70 kilodalton dextran em cada poço, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da incubação, remova a placa da incubadora e lave as células seis vezes com 100 microliters de HBSS. Após a última lavagem adicione 100 microlitros de HBSS pré-armados às células e, em seguida, coloque a placa em um microscópio com um palco e câmara aquecidos.
Após ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e fluoresceína conforme necessário, adquira uma imagem de cada poço alternando entre os dois fluoroforos entre cada poço. Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permaneceram em foco em toda a placa, em seguida, adquirir imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos para o tempo desejado. Durante a aquisição da imagem, ajuste o pH de uma alíquota de 50 mililitros de uma solução rica em potássio tamponada com HEPES de 25 milialares a 7,5 usando 10 ácido clorídrico molar, ou 10 hidróxido de potássio molar conforme necessário.
Em seguida, ajuste o pH de 350 mililitros aliquots da solução rica em potássio tamponada com MES de 25 milimilhas para pH 6.5, pH 5.5 e pH 5.0. Uma vez concluída a aquisição da imagem, remova o HBSS da placa de 96 poços contendo as células e adicione a solução rica em potássio em pH 7.5. Em seguida, adicione nígericina em uma concentração final de 10 microgramas por mililitro.
Coloque a placa de volta no microscópio e adquira imagens de cada poço usando as mesmas configurações de aquisição que demonstradas anteriormente. Para medir eventos oxidativos dentro de macropinossomos, as células RAW264.7 em uma placa de 96 poços um dia antes do ensaio, como demonstrado anteriormente. Em seguida, no dia do ensaio lavar todos os poços com 100 microliters de HBSS pré-armados a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulados 70 kilodalton dextran e 0,025 miligramas por mililitro de H2DCFDA rotulados 70 kilodalton dextran para cada poço, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de remover a placa da incubadora, lave as células seis vezes com 100 microliters de HBSS. Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de HBSS a cada poço e coloque a placa no microscópio.
Depois de ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e H2DCFDA conforme necessário, adquira imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos, como demonstrado anteriormente. Para medir a digestão proteica dentro dos macropinossomos, as células raw264.7 sementes um dia antes do ensaio, como demonstrado anteriormente. Em seguida, no dia do ensaio lavar todos os poços com 100 microliters de HBSS pré-armados a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione 100 microliters de HBSS contendo 0,025 miligramas por mililitro de TMR rotulado 70 kilodalton dextran em 0,2 miligramas por mililitro BODIPY rotulado ovalbumin para cada poço. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Depois de remover as células da incubadora, lave-as seis vezes com 100 microliters de HBSS.
Após a última lavagem adicione 100 microlitros de HBSS a cada poço, em seguida, coloque a placa no microscópio. Depois de ajustar os parâmetros de excitação e emissão para TMR e BODIPY conforme necessário, adquira imagens de cada poço em intervalos de um a 15 minutos, como demonstrado anteriormente. Ao medir o pH, eventos oxidativos ou degradação proteica em macropinossomos, a dinâmica da acidificação não pode ser medida por um determinado período de tempo correspondente à fase de carregamento do dextran, que varia dependendo do tipo celular utilizado.
Ao medir o pH macropinoso, a relação fluoresceína e TMR se tornará progressivamente menor e irá subir dentro dos 15 minutos de aquisição. Este platô corresponde a um pH de aproximadamente cinco, que corresponde aproximadamente ao pH de lysososomes. Ao final de cada aquisição, é realizada uma calibração In situ.
A relação fluoresceína para TMR deve ser maior dentro do buffer de calibração no pH 7.5 e tornar-se progressivamente menor à medida que os buffers de calibração se tornam mais ácidos. Isso permite a geração de uma curva de calibração. Ao medir eventos oxidativos dentro de macropinossomos, a razão de H2DCFDA para TMR se tornará progressivamente maior e provavelmente irá subir nos primeiros 20 a 30 minutos em uma célula RAW264.7 ativada.
Ao medir a digestão da proteína macropinosômica, um sinal de fluoresceína progressivamente forte será liberado à medida que o ovalbumina for digerido. Nas células RAW264.7, o aumento da fluorescência liberada da ovalbumina rotulada bodipy digerida, será platô nos primeiros 30 minutos. Com esse papel emergente na homeostase e sua relevância recém-descoberta para a patologia do câncer, uma pesquisa de macropinocose renascentista está em andamento.
Esses métodos foram fornecidos a uma caixa de ferramentas para explorar a contribuição da macropinocitose para esses campos de estudo.
