Bu protokol, bireysel makropinozomların lümeni içinde çeşitli süreçlerin ve biyokimyasal parametrelerin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu yöntemler makropinositozun hücre biyolojisinde ilaç keşfi için kullanılabilir. Bu protokol hem hücresel hem de organel düzeyde heterojenliği ortaya çıkarma avantajı sağlar.
Tahlil tohumu Raw264.7 hücresinden bir gün önce, beş kat 10'luk bir yoğunlukta, hücrelerin gücüne kuyu başına 100 mikrolitre, siyah kenarlı bir cam alt 96 kuyu plakasında. Tahlil günü kuyuların en az %70 birleştiğinde kontrol edin. Daha sonra tüm kuyuları 37 santigrat derecede önceden uyarılmış 100 mikrolitre HBSS ile yıkayın.
Daha sonra, her kuyuda 70 kilodalton dektran etiketli 70 kilodalton dextran etiketli TMR mililitresi başına 0.025 miligram ve 70 kilodalton dekstran etiketli 0.025 miligram içeren 100 mikrolitre HBSS ekleyin, ardından hücreleri 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre HBSS ile altı kez yıkayın. Son yıkamadan sonra hücrelere 100 mikrolitre önceden ısıtılmış HBSS ekleyin, ardından plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazneli bir mikroskop üzerine yerleştirin.
TMR ve floresan için uyarlama ve emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarladıktan sonra, her kuyunun arasındaki iki florofor arasında değişen her kuyudan bir görüntü elde edin. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin, ardından istenen süre boyunca her kuyunun görüntülerini bir ila 15 dakikalık aralıklarla elde edin. Görüntü alımı sırasında, 25 milimolar HEPES ile tamponlanmış potasyum bakımından zengin bir çözeltinin 50 mililitrelik aliquotunun pH'ını gerektiğinde 10 molar hidroklorik asit veya 10 molar potasyum hidroksit kullanarak 7,5'e ayarlayın.
Ardından, 25 milimoler MES ile tamponlanmış potasyum zengin çözeltisinin 350 mililitrelik aliquots pH'ını pH 6.5, pH 5.5 ve pH 5.0'a ayarlayın. Görüntü alımı tamamlandıktan sonra, HBSS'yi hücreleri içeren 96 kuyu plakasından çıkarın ve potasyum bakımından zengin çözeltiyi pH 7.5'e ekleyin. Daha sonra mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyonda Nijerin ekleyin.
Plakayı mikroskopa geri yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi aynı alım ayarlarını kullanarak her kuyunun görüntülerini alın. Makropinozomlar içindeki oksidatif olayları ölçmek için, daha önce gösterildiği gibi testten bir gün önce 96 kuyulu bir plakada RAW264.7 hücrelerini tohumladı. Daha sonra tahlil günü tüm kuyuları 37 santigrat dereceye kadar önceden uyarılmış 100 mikrolitre HBSS ile yıkayın.
Daha sonra, her kuyuya 70 kilodalton dektran etiketli mililitre başına 0.025 miligram ve 70 kilodalton dektran etiketli H2DCFDA mililitresi başına 0.025 miligram içeren 100 mikrolitre HBSS ekleyin, ardından hücreleri 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Plakayı inkübatörden çıkardıktan sonra hücreleri 100 mikrolitre HBSS ile altı kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre HBSS ekleyin ve plakayı mikroskop üzerine yerleştirin.
TMR ve H2DCFDA için heyecan ve emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarladıktan sonra, her kuyunun görüntülerini daha önce gösterildiği gibi bir ila 15 dakikalık aralıklarla elde edin. Makropinozomlar içindeki protein sindirimini ölçmek için, daha önce gösterildiği gibi, testlerden bir gün önce RAW264.7 hücrelerini tohumlamak. Daha sonra tahlil günü tüm kuyuları 37 santigrat derecede önceden uyarılmış 100 mikrolitre HBSS ile yıkayın.
Daha sonra, her kuyuya mililitre BODIPY etiketli ovalbumin başına 0,2 miligram olarak 70 kilodalton dextran etiketli mililitre TMR başına 0,025 miligram içeren 100 mikrolitre HBSS ekleyin. Daha sonra plakayı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücreleri inkübatörden çıkardıktan sonra, 100 mikrolitre HBSS ile altı kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra her kuyuya 100 mikrolitre HBSS ekleyin, ardından plakayı mikroskop üzerine yerleştirin. TMR ve BODIPY için heyecan ve emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarladıktan sonra, her kuyunun görüntülerini daha önce gösterildiği gibi bir ila 15 dakikalık aralıklarla elde edin. Makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar veya protein bozulması ölçülürken, kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişen dektran yükleme aşamasına karşılık gelen belirli bir süre boyunca asitleşme dinamikleri ölçülemez.
Makropinozom pH'ı ölçerken, floresan-TMR oranı giderek küçülecek ve satın alma işleminden sonraki 15 dakika içinde platolaşacaktır. Bu plato, lizozomların pH'sıyla kabaca eşleşen yaklaşık beş pH'a karşılık gelir. Her alımın sonunda bir In situ kalibrasyonu gerçekleştirilir.
Floresan-TMR oranı, pH 7.5'teki kalibrasyon tamponu içinde en büyük olmalı ve kalibrasyon tamponları daha asidik hale geldikçe giderek küçülmelidir. Bu, bir kalibrasyon eğrisinin üretilmesini sağlar. Makropinozomlar içindeki oksidatif olayları ölçerken, H2DCFDA'nın TMR'ye oranı giderek daha büyük hale gelecek ve aktif bir RAW264.7 hücresinde ilk 20 ila 30 dakika içinde platolanacaktır.
Makropinosomal protein sindirimi ölçülürken, ovalbumin sindirildikçe giderek daha güçlü bir floresan sinyali serbest kalacaktır. RAW264.7 hücrelerinde, sindirilen BODIPY etiketli ovalbumin'den kurtarılan floresan artışı ilk 30 dakika içinde plato yapacaktır. Homeostazda ortaya çıkan bu rol ve kanser patolojisi ile yeni keşfedilen ilgisi ile rönesans makropinositoz araştırmaları şu anda devam etmektedir.
Bu yöntemler, makropinositozun bu çalışma alanlarına katkısını keşfetmek için bir araç kutusuna sağlanmıştır.
