השימוש במצעי אנרגיה שונים הוא גם ספציפי לסוג התא וגם מעיד על מחלה. מדידת הצריכה של המצעים הספציפיים יכולה לשפוך אור הן על הביולוגיה הרגילה והן על הפתולוגיה. הטכניקה אינה זקוקה לציוד מיוחד וקלה להרחבה.
הוא גם קל יותר לשימוש מאשר שיטות קודמות שפורסמו. הבנת השינויים בקצב חמצון המצע תאפשר התפתחות של התערבויות תזונתיות ופרמקולוגיות להפרעות מטבוליות. למרות שהיא מודגמת עם רקמת עצם טכניקה זו מותאמת אישית בקלות כדי לחקור גמישות מטבולית בכל סוגי התאים ומספקת הבנה הן של הגורמים והן של ההשלכות של שינויים מטבוליים.
לאחר הקרבת הגורים במשך שלושה עד חמישה ימים לאחר הלידה, העבירו אותם ל-D PBS קר כקרח המכיל תמיסת אנטיביוטיקה כפולה לפניצילין סטרפטומיצין. חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחור לחזית ב- D PBS.
מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא. מכינים 2 ו-4 מיליגרם לתמיסות מיליליטר של קולגן מסוג 2 ב-D PBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר טרי. ראשית, לעכל את הקלבריה המנוקה עם שני מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את תמיסת העיכול.
לאחר מכן, לעכל את הדגימות הנקיות בארבעה מיליגרם לכל מיליליטר קולגן תמיסה שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם. לאחר מכן, משכו את תמיסת העיכול ושמרו אותה. סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכלאט ב-300 RCF למשך חמש דקות.
להשעות מחדש את גלולת התא במדיום אלפא MEM מלא המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. לספור ולזרוע את התאים בצלחת של 10 סנטימטרים. תרבית את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שלושה ימים.
לאחר מכן, נתקו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 0.25 טריפסין EDTA. לאחר העיכול, ספרו וזרעו את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 היטב עם מדיום אלפא MEM שלם המכיל 10%FBS ופניצילין סטרפטומיצין תמיסה אנטיביוטית כפולה. זרעו לפחות ארבע בארות לכל סוג תא לכל מצע, ולפחות שלוש בארות נוספות לכל סוג תא לספירה לפני הבדיקה.
תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס בן לילה. לאחר הסרת השריר ורקמת החיבור מעכברים בני שמונה שבועות ואיסוף עצם הירך והטיביות, חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים. שטפו את מח העצם מעצם הירך מעצם הירך וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי טרייה בקוטר 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 מדים המכילה 15 מיליליטרים של מדיום אלפא MEM שלם עם תמיסת אנטיביוטיקה כפולה של 10% פניצילין סטרפטומיצין, ו-10% CGM 14 12 בינוני מותנה.
תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימים משליכים את מדיית התרבית ושוטפים את התאים ב-D PBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין EDTA למשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא בתווך BMM. לספור ולזרוע את התאים בצלחת תרבית תאים של 24 באר לפי ההליך שתואר קודם לכן. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת המבחנים.
שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים עם D PBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין EDTA. להשעות מחדש 20 מיקרוליטרים של תאים מעוכלים ב- D PBS.
עם 20 מיקרוליטרים של תמיסת צבע כתום אקרידין ופרופידיום יודיד, קבעו את מספר התאים החיים עם מונה תאים אוטומטי ותעדו את המספר. לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם D PBS. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה המנוע המיועד לתרביות רקמה המיועדות ל-RAM.
לאחר איטום הצלחת עם parafilm, דגירה של התאים באינקובטור המיועד RAM ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות. במהלך הדגירה, חותכים נייר מסנן לחתיכות עגולות, מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינור המיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך הכובע. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חומצה פרכלורית טוחנת אחת לכל צינור ו-20 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך הפקק.
לאחר דגירה של התאים, מעבירים 400 מיקרוליטרים של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הפקקים באופן מיידי. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה. מקבילים במהלך הדגירה הקימו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור וממלאים אותו בארבעה מיליליטרים של נוזל נצנוץ.
מעבירים כל פיסת נייר מסנן לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, על אמבט המים, על המקרר, על האינקובטור, על הכיור, על הקרקע ועל כל אזור עבודה אחר לאיתור זיהום פוטנציאלי של זיכרון RAM. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.
מדוד את פעילות הרדיו של פחמן 14 בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ ותעד את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה, על פי הנחיות בטיחות הקרינה, במידת הצורך. האיור משווה חמצון מצע על ידי קלבריה ראשונית קדם-אוסטאובלסטים לעומת BMMs.
לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתורגבים בתרבית במדיום אלפא MEM שלם בן לילה, הם בדרך כלל מגיעים למפגש של 80 עד 90% ומציגים את המורפולוגיה האופיינית להם. הקדם-אוסטאובלסטים הקלבריאליים גדולים משמעותית מ-BMMs. התוצאות של חמצון המצע הראו כי קצב החמצון של כל מצע גבוה משמעותית בפרה-אוסטאובלסטים של קלבריה מאשר ב-BMMs, מה שככל הנראה מצביע על ייצור אנרגיה גבוה יותר על ידי זרחון חמצוני בפרה-אוסטאובלסטים.
הנייר השלישי שהוכנס צריך להיות מעט גדול יותר ממכסה צינור עליון של 1.7 מיליליטר. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם צריכת חמצן ולקבוע את הקצב הכולל של זרחון חמצוני וייצור הנקה בתאים. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השימוש במצע במהלך שלבי הבחנה שונים או הגדרות מחלה.
עם הידע הזה אנחנו יכולים לפתח התערבויות עבור הפרעות מטבוליות.
