מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה על ידי שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה. חלבוני פלזמה היו מואצים עם אתנול ודגימות מרוכזים, והושעו מחדש בשלב הנייד, לפני הזרקת ציוד UPLC. תרכובות זוהו באמצעות ספרייה ממוקדת למחצה שהורכבה במעבדה, באמצעות מנהל PCDL עבור מטבולומיקה, תוכנה ומאגרי מידע מקוונים שונים בחינם.
יישמנו התערבות תזונתית עם מאפין ומשקאות מנוסחים עם קמח זרעי brosimum alicastrum. בסוף ההתערבות, המצב התזונתי והסרקופי של המשתתפים שופרו, והתוכן הפנולי הכולל של פלזמה הוגדל. אבל אנחנו צריכים לזהות אילו תרכובות פנוליות נספגו ותרמו את ההשפעה החיובית.
זיהוי וכימות של תרכובות פנוליות הנספגות לאחר צריכת מזונות עשירים בנוגדי חמצון אלה היא משימה קשה אך הכרחית, אם יש צורך להדגים פעילות ביולוגית של פיטוכימיקלים אלה. הזמינות הביולוגית של רוב הרכיבים הפנוליים נמוכה, יתר על כן פחות מ -5% מהם נכנסים ללא טרנספורמציה מבנית לפלסמה. רובם עוברים מספר ביו-טרנספורמציה, כגון מתילציה, סולפונציה או גלוקורונידציה.
מגוון רחב של מחקרים זיהה את המטבוליטים הנפוצים ביותר בפלואידים ביולוגיים על ידי UPLC-MS ו- UPLC-MS / MS. עם זאת, חלק גדול של מטבוליט חיידקים אינו מדווח על היעדר מסדי נתונים המכילים את המידע המלא שלהם. זיהוי מטבוליט מסובך על ידי העלות והזמינות המסחרית של תקני מטבוליט.
לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר עשויה להיות לא ממוקדת או ניתוח מטבוליטים MS/MS ממוקד למחצה. ניתוח זה מסתמך על השימוש במידע תכונה מולקולרית, מסה ליחס טעינה מונואיזוטופית מסה מדויקת, התפלגות איזוטופית, ודפוס פיצול. כדי לקבוע את הזהות הכימית ולהשוות אותו עם מסדי נתונים מקוונים זמינים בחינם המכילים מטבוליטים פוליפנול מזוהה ביופלואידים לאחר צריכת דיאטות עשירות פוליפנול.
במחקר הנוכחי, פיתחנו שיטת UPLC-MS/MS ממוקדת למחצה לניתוח דגימות הפלזמה של קבוצת קשישים המעורבים בהתערבות תזונתית. לאחסן דגימות פלזמה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. להפשיר דגימות פלזמה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות או ב 37 צלזיוס במשך חמש דקות.
מניחים 200 מיקרוליטרים של דגימת פלזמה במיקרו-צינור שני מילימטר ומערבבים עם 1000 מיקרוליטרים של אתנול טהור. דגימת פלזמה מערבולת במשך 30 שניות. דגימת צנטריפוגה ב-6, 580 כוח צנטריפוגלי לחמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, לאסוף את supernatant עם micropipette או פיפטה פסטר ומניחים אותו microtube חדש. שמור את הסופר-נרטיב. מערבבים גלולה עם 1000 מיקרוליטר אתנול טהור, קודקוד במשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה באותם תנאים.
לאסוף את supernatant ולערבב עם supernatant הראשון. הסר אתנול מן המדגם באמצעות חנקן טהור ב 135 פסאיי. שמור את המחט סנטימטר אחד מן החלק העליון של microtube כדי למנוע אובדן מדגם לשטוף עד מדגם יבש.
Resuspend דגימות יבשות ב 100 microliters של אחד הוא תערובת אחת של אצטוניטריל עם מים. סנן דרך קרום מזרק ניילון 45 מיקרו ישירות לתוך HPLC בקבוקון מיקרו להוסיף להזריק שלושה מיקרוליטרים של מדגם על UPLC מצויד C 18 הפוך פאזה עמודה. הגדר את טמפרטורת הדגימה האוטומטית על 20 מעלות צלזיוס ואת תרמוסטט הטור ב 25 צלזיוס.
הזרקו כל דגימה בשלושה עותקים. השתמש 0.1% חומצה פורמית במים כמו ממס A, ו 100% acetonitrile כמו ממס B.הגדר את קצב הזרימה ב 0.4 מילימטרים לדקה ותוכנית הדרגתית כדלקמן, אפס עד דקה אחת 10%B, דקה אחת עד ארבע דקה 30%B, ארבע עד שש דקות 38%B, שש עד שמונה דקות 60%B, שמונה עד 8.5 דקות 60%B, 8.5 עד תשע דקות 10%B. הגדר את ספקטרומטר המסה ביינון מצב שלילי.
השתמש חנקן כמו גז ייבוש ב 300 צלזיוס וקצב הזרימה ב 13 ליטר לדקה. הגדר את לחץ nebulizer ב 30 פסאיי. הגדר מתח נימי ב 4, 000 וולט, מתח מקוטע ב 175 וולט, ומתח Skimmer ב 65 וולט.
סרוק את המסות בין 100 ל 1100 מ '/z ועבור ספקטרומטריית המסה, סרוק מסות בין 50 ל 1000 מ '/z. הגדר רכישת נתונים למצב MS/MS אוטומטי. השתמש במסת ההפניה הבאה, 119.036 ו- 966.0007.
חפש תרכובות פנוליות, מטבוליטים פנוליים ותרכובות אחרות של עניין בספרות מדעית. פתח את תוכנת ניהול מסדי הנתונים הכלולה במערכת UPLC. בחר קובץ ולאחר מכן בחר ספריה מורכבת חדשה של מסד נתונים אישי, PCDL.
לאחר מכן בחר, צור PCDL חדש. בחר את סוג חילוף החומרים PCDL LC/MS. הגדר את השם עבור PCDL.
לאחר מכן בחר צור. בסרגל הכלים, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה. לאחר מכן לחץ על לחצן חפש תרכובות.
ניתן להוסיף תרכובות לספרייה האישית בשתי דרכים, תחילה על-ידי העתקתן מהספרייה הכללית של המכשיר. לשם כך, פתח את מסד הנתונים הקיים של המכשירים הכלולים בניהול הנתונים עד כה. לחץ על הלחצן חפש תרכובות.
באפשרות החיפוש היחיד, הזן את קריטריוני החיפוש המורכבים כדי למצוא את דריבית הריבית. בטבלת התוצאות המורכבות, בחר את דריבית הריבית. כדי לבחור יותר ממתחם אחד, לחץ על המתחם הראשון ולאחר מכן החזק את מקש CTRL לחוץ ולאחר מכן לחץ על כל דריכת ריבית.
לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל התרכובות המסומנות ובחר צרף ל- PCDL. בחלון החדש, חפש ובחר את קובץ מסד הנתונים האישי המיוחד. סמן את התיבה כלול ספקטרום עבור תרכובת אם קיימת.
לחץ על לחצן צרף. בתיבת הדו-שיח החדשה, בחר כן כדי לבדוק את התרכובות החדשות שנוספו. בחר לא כדי להמשיך לחפש תרכובות עניין נוספות.
שנית, ניתן להוסיף תרכובות חדשות באופן ידני אם הן אינן זמינות בספריה הכללית של המכשיר. עבור זה פתוח, מסד הנתונים האישי המיוחד. לאחר הפתיחה, בחר PCDL ולאחר מכן באפשרות אפשר עריכה.
בחרו באפשרות 'עריכה של תרכובות'. לחץ על לחצן הוסף חדש. בחלק העליון של החלון, השלם את המידע של המתחם החדש.
מלא את הנוסחה, השם, שם IUPAC, מספר CAS, מזהה Chemspider ומזהים אחרים. באמצעות מידע הזמין בספריות המקוונות החינמיות, Chemspider, PubChem, ו- Phenol Explorer כדי למלא את המידע של דריבית העניין החדשה. לאחר שתסיים, לחץ על הלחצן שמור כחדש כדי לשמור את המידע המורכב החדש במסד הנתונים האישי המיוחד.
חזור על התהליך עם כל תרכובות העניין כדי להשלים את מסד הנתונים האישי המיוחד. השתמש בתוכנת המנהל האיכותי של המכשיר כדי לזהות תרכובות פנוליות ומטבוליטים פנוליים. פתח את הקובץ לדוגמה.
בחלונית Chromatogram, בחר להגדיר Chromatograms ולחלץ את סך כרומטוגרמה יון TIC, שחולצו יון-כרומטוגרמה של MS EIC ו- EIC של MS / MS. בחר באפשרות שילוב כרומטוגרמה. בחלונית 'חיפוש תרכובות', בחרו 'חפש לפי אפשרויות נוסחה'.
בחלון החדש, בחר מקור נוסחה ולאחר מכן באפשרות ספריית קו נטוי של מסד הנתונים. מצא את מסד הנתונים האישי שנוצר בעבר ולחץ על פתוח. בחר באפשרות התאמת הנוסחה והגדר עמידות להתאמה המונית של חמישה חלקים למיליון, ppm.
בחרו באפשרות היונים השליליים ובחרו בתיבת הדו-שיח מינוס H בלבד. באפשרות התוצאות, סמן את החילוץ EIC, חלץ ספקטרום נקי, חלץ ספקטרום גולמי וכלול תיבות דו-שיח מובנות. בחר באפשרות מסנני התוצאות.
ואז לסמן להזהיר אם הציון הוא, ולאחר מכן להגדיר את משחק הניקוד ב 80%ואז לסמן לא להתאים אם הציון הוא ולהגדיר את הציון ב 75%ואז לחץ על תרכובות למצוא על ידי תרכובות לפי נוסחה כדי לזהות תרכובות של עניין במדגם. תהליך צעד אחר צעד לזיהוי מטבוליטים פנוליים באמצעות ניתוח UPLC MS / MS ממוקד למחצה של דגימות פלזמה מוצג באיור הבא. ראשית, סך כל יון-כרומטוגרמה הושג באמצעות מסד נתונים PCDL שנוצר באופן עצמי שהכיל 645 תרכובות פנוליות ואת המטבוליטים שלהם, שהתקבלו ממסדי נתונים מקוונים בחינם.
לאחר מכן, יון-כרומטוגרמה שחולצה ודפוס פיצול, או היונים עם פחות מחמש ppm מסה, סובלנות התאמה הושגו. לבסוף, ההתפלגות האיזוטופית של הפסגות שזוהו הושוותה לזו של התרכובות התיאורטיות. מניתוח זה, בסך הכל 25 תרכובות פנוליות ומטבוליטים זוהו בדגימות הפלזמה.
כדי להעריך את האפקטיביות של שיטת העיצוב בזיהוי של תרכובות פנוליות לספוג או המטבוליטים שלהם, חמש דגימות של משתתפי המחקר הושגו לפני ואחרי התערבות 30 יום נותחו. השפע היחסי של כל תרכובת חושב על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה לאחר הטיפול על ידי AUC לפני הטיפול. טבלה 4 מציגה את הרשימה של 12 תרכובות פנול שהראו עלייה בפלזמה לאחר צריכת 30 יום של קמח brosimum alicastrum המכיל מזונות.
חומצה פנילאצטית היה רק מטבוליט נמצא באופן עקבי בריכוז גבוה יותר לאחר הטיפול. גליציטין, איזופלבון גליקוסילאט, ושלוש חומצה הידרוקסיפנית גדלו בשלוש מתוך חמש הדגימות, אך ירדו בשתיים האחרות. Gomisin M2, ליגנן, זוהה בשלוש מתוך חמש דגימות רק לאחר ההתערבות התזונתית.
תרכובות פנוליות אחרות מטבוליטים נמצאו רק במדגם אחד ורק לאחר הטיפול. השיטה שפיתחה נייר נוכחי, מראה כי ברוב החלקים זה היה מתאים היטב למטרה שלשמה הוא נוצר. המדגם לכל טיפול היה פשוט ויעיל.
הפרדת UPLC וזיהוי MS/MS ממוקד למחצה של מטבוליטים פנוליים הושגו.
