אנו מדגימים אינספור שיטות לכל בקרה אופטית ותצפית על פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקת רעילות. לאפשר כימות רב-פרמטרי של הדפוסים הפנוטיפיים בזמן ובמרחב, לאפשר התבוננות בהשפעת התרופות לאורך שעות או ימים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של תאים, כגון, נוירונים, או תאי בטא, עבור סינון פונקציונלי ובדיקת רעילות.
מי שידגים את ההליך יהיה וואן-צ'י סו, מהנדס ביו-הדמיה מהמעבדה שלי. הכינו את הצלחת מרובת הבארות לפני הסרת קרדיומיוציטים iPSC מאחסון קר להפשרה. מצפים כל באר של צלחת מיקרו 96 באר עם 100 מיקרוליטר של 0.02% תמיסת ג'לטין עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונקטין כדי לכסות את כל המשטחים ביסודיות.
העבר את הקרדיומיוציטים של iPSC ממיכל אחסון החנקן הנוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. קח את הבקבוקון לארון בטיחות ביולוגי מדרגה שתיים, והעבר בעדינות את התכולה לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום טמפרטורת החדר. צנטריפוגה של התאים ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
יש להשליך את הסופר-נאטנט על ידי פיפטה, ולהשעות בעדינות את התאים במיליליטר אחד של מדיום עם מעכב 10 מיקרומולר ROCK Y27632. תאי צלחת ציפו 96 לוחות באר בצפיפות של 100, 000 עד 150, 000 תאים לסנטימטר מרובע, לפי הוראות היצרן. לאחר 24 שעות, ודא כי התאים המחוברים לפני השטח של הצלחת נמצאים במגע עם תאים אחרים.
לאחר ציפוי התאים במשך 72 שעות להפשיר את ערכות הנגיף GECIs על קרח. הכינו פתרון מלאי של ערכה ויראלית בעוצמה כפולה עם מדיום התחזוקה. הכן את התאים לזיהום על ידי התאמת הנפח הבינוני ל -100 מיקרוליטר לבאר.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסה נגיפית מעורבבת מראש לבארות, ודגרו במשך שמונה עד 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להחליף עם 200 microliters מראש מחומם בינוני. דמיינו את ביטוי ה-GECIs 24 שעות לאחר ההתמרה באמצעות מערכת הדמיה.
שמור על תאים באינקובטור הלח לפני ביצוע בדיקות פונקציונליות. הפעל את כל המכשירים של מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה. ודא שטמפרטורת התא מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס עם תוספת של 5% פחמן דו-חמצני.
פתח את תוכנת ההדמיה ובחר את הגדרת הצלחת עבור צלחת 96 באר. הכניסו לתא צלחת באר 96 ללא מכסה, וטענו את טבעת איטום התאים החיים מעליה. בחר את העדשה האובייקטיבית לטבילה במים של 20X, 60X ו- 20X, בהתאם לרזולוציה המרחבית הנדרשת.
התאם את המיקוד כדי לצלם תמונות ברורות לפני הרכישה הניסיונית. בחר שלושה עד חמישה אזורים באופן אקראי לכל באר לרישום פעילות סידן. בחר מסננים מתאימים עבור מחוונים שונים.
הגדר את עוצמת הדיודה פולטת האור המתאימה לכל ערוץ הדמיה שנעשה בו שימוש. הגדר את זמן החשיפה של המצלמה למקסימום של 40 אלפיות השנייה או 25 הרץ, ומשך הקלטה של 30 שניות לרכישת זרם כדי לצפות בטרנזיינטים של סידן, שדווחו על ידי בדיקות MNG-GECO ו- K-GECO המתבטאות בקרדיומיוציטים. הגדל את עוצמת ה-LED אם יחס האות לרעש הוא פחות משניים בקצבי פריימים גבוהים יותר.
עבור גירוי אופטוגנטי, מטב את העוצמה והתדירות של אור כחול בהרץ אחד, והתחל ברכישה. להשעות מחדש את ה-E4031 Dofetilide, ואת ה-Verapamil ב-DMSO, ולדלל אותם עם החיץ של Tyrode. סדרו תרכובות לבאר היעד המתאימה.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תרכובת הכוח הכפול באמצעות מערכת המיקרו-נוזלים האוטומטית לתוך הבארות, והתחילו ברכישה לאחר תקופת הדגירה הרצויה. בודד את אזור האות מהרקע על ידי זיהוי אוטומטי של תכונת הפולסים, ברזולוציית זמן, באמצעות התוכנה. השתמש בתוכנת ניתוח שיא הסידן כדי לנתח את תדירות הפעימה, אות השיא, משך ארעי הסידן 50% משך ארעי הסידן 90% זמן עלייה וזמן דעיכה.
התצפית של תנודות סידן ספונטניות ב- NMG-GECO המתבטאת על ידי קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC עם או בלי טיפולים תרופתיים מודגמת בסרטון. עקבות קינטיים שהושגו באמצעות MNG-GECO הראו כי מעכבי תעלות יונים מולקולריות קטנות Verapamil, Dofetilide ו- E4031 השפיעו על טרנזיינטים של סידן כצפוי. כדי להעריך את תגובת המינון של E4031 בתנאים מתוקננים וקצביים channelrhodepsin-2, ו- K-GECO המבטאים CMs iPSC נשלטו אופטית באמצעות פולסים של הרץ אחד ו-470 ננומטר של אור, ונצפו באמצעות האות K-GECO האדום.
הפחתה הדרגתית של משרעת שיא, ועלייה בזמן הדעיכה של ארעי הסידן, מתרחשות עם ריכוזים הולכים וגדלים של E4031. השפעה תלוית מינון של E4031 הייתה בולטת ביותר עבור הירידה באמפליטודת השיא. ארעי סידן צלולים נשארים גלויים לעין חודש לאחר ההתמרה הנגיפית, או ללא האור הנוסף המשמש לקצב אופטי.
הגרף מתאר תרופה שנראית כמגבירה את קצב הפעימה, מסדירה את מרווח ההתכווצות ומגדילה את משרעת הסידן החולפת, במצב LVNC iPSC CM. השונות של תדירות הפעימה, וההשפעה שלאחר מכן על משך הזמן החולף של הסידן, משתנות גם הן כאשר iPSC CM נשמרים בתרבית. מספר GECIs, כולל, ER LAR-GECO, MTG-Sepia ו- NIR-GECO, פותחו לביטוי בנפרד, או בשילוב במודלים תאיים למדידת פעילות סידן בזמן אמת הנובעת ברשתית האנדופלסמית, הרשתית הסרקופלסמית, המיטוכונדריה וציטוסול, בהתאמה.
ניתן לשלב את ה-GECIs במודל iPSC CM כדי לחקור מאגרי סידן תוך-תאיים שונים. K-GECO המבטא קרדיומיוציטים הראה התנהגות מכות עקבית לאורך זמן. עם זאת, העמסת Fluo-4 השפיעה על שניהם, על תדירות הפעימה, ועל CTD במודל זה, מה שמרמז על כך ש-Fluo-4, כשלעצמו, עשוי להשפיע על התוצאות של ניסויים כאלה.
אנו מספקים דרך פשוטה לחקור פרופילים פנוטיפיים מתאי בקרה ותאים שמקורם בחולה, בעוד ש-iPSC ביניים עשוי לשפוך אור על גילוי תרופות במחלות שונות.
