우리는 고처리량 약물 스크리닝 및 독성 테스트를 위해 iPSC 유래 심근 세포에서 유발된 세포 활동의 모든 광학 제어 및 관찰을 위한 수많은 방법을 시연합니다. 시간과 공간에서 표현형 패턴의 다중 매개 변수 정량화를 가능하게하여 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 약물의 효과를 관찰 할 수 있습니다. 이 방법은 기능적 스크리닝 및 독성 시험을 위해 뉴로스 또는 베타 세포와 같은 다른 유형의 세포에 적용될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 바이오 이미징 엔지니어 인 Wan-Chi Su가 될 것입니다. iPSC 심근 세포가 해동을 위해 냉장 보관에서 제거되기 전에 멀티 웰 플레이트를 준비하십시오. 96웰 마이크로 플레이트의 각 웰을 100마이크로리터의 0.02% 젤라틴 용액으로 피브로넥틴 밀리리터당 50마이크로그램으로 코팅하여 모든 표면을 완전히 덮습니다.
iPSC 심근 세포를 액체 질소 저장 탱크에서 섭씨 37 도의 수조로 옮깁니다. 바이알을 클래스 2 바이오 안전 캐비닛으로 가져가 내용물을 9 밀리리터의 실온 배지가 들어있는 새로운 15 밀리리터 원추형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 G를 200배로 원심분리한다.
피펫으로 상청액을 버리고 10 마이크로몰 ROCK 억제제 Y27632를 사용하여 1밀리리터의 배지에 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 플레이트 셀은 제조업체의 지침에 따라 평방 센티미터 당 100, 000에서 150, 000 셀의 밀도로 96 웰 플레이트를 코팅했습니다. 24 시간 후, 플레이트 표면에 부착 된 세포가 다른 세포와 접촉하는지 확인하십시오.
세포를 72시간 동안 플레이팅한 후 GECIs 바이러스 키트를 얼음 위에서 해동시켰다. 유지 매체로 이중 강도 바이러스 키트 스톡 용액을 준비하십시오. 배지 부피를 웰당 100 마이크로리터로 조정하여 감염을 위해 세포를 준비합니다.
미리 혼합 된 바이러스 용액 100 마이크로 리터를 웰에 첨가하고 섭씨 37도에서 8-16 시간 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로 리터의 예열 된 배지로 교체하십시오. 이미징 시스템을 사용하여 형질도입 후 24시간 후에 GECI 발현을 시각화합니다.
기능 분석을 수행하기 전에 가습 인큐베이터에서 세포를 유지하십시오. 고콘텐츠 이미징 시스템의 모든 장치를 켭니다. 37%이산화탄소 보충으로 챔버 온도가 섭씨 5도에 도달하는지 확인합니다.
이미징 소프트웨어를 열고 96웰 플레이트의 플레이트 설정을 선택합니다. 뚜껑이 없는 96웰 플레이트를 챔버에 넣고 라이브 셀 밀봉 링을 위에 놓습니다. 필요한 공간 해상도에 따라 20X, 60X 및 20X 수침 대물 렌즈를 선택하십시오.
실험적으로 획득하기 전에 선명한 이미지를 촬영하도록 초점을 조정합니다. 칼슘 활동 기록을 위해 웰당 무작위로 3-5개의 영역을 선택합니다. 다른 지표에 적합한 필터를 선택하십시오.
사용되는 각 이미징 채널에 적합한 발광 다이오드 전력을 설정합니다. 심근 세포에서 발현되는 MNG-GECO 및 K-GECO 프로브에서 보고한 칼슘 과도 현상을 관찰하기 위해 스트림 획득을 위한 카메라 노출 시간을 최대 40밀리초 또는 25Hz로 설정하고 스트림 획득을 위한 녹화 지속 시간을 30초로 설정합니다. 더 높은 프레임 속도에서 신호 대 잡음비가 2보다 작으면 LED 전력을 높입니다.
광유전학적 자극의 경우, 1헤르츠에서 청색광의 전력과 주파수를 최적화하고 획득을 시작하십시오. E4031 도페틸리드와 베라파밀을 DMSO에 다시 현탁하고 티로드의 완충액으로 희석합니다. 해당 표적 우물에 화합물을 배열하십시오.
자동 미세 유체 시스템을 통해 100 마이크로 리터의 이중 강도 화합물을 웰에 추가하고 원하는 배양 기간 후에 수집을 시작하십시오. 소프트웨어로 시간 분해능에 따른 펄스 기능을 자동으로 감지하여 신호 영역을 배경에서 분리합니다. 칼슘 피크 분석 소프트웨어를 사용하여 박동 주파수, 피크 신호, 칼슘 과도 지속 시간 50 % 칼슘 과도 지속 시간 90 % 상승 시간 및 붕괴 시간을 분석하십시오.
약물 치료 유무에 관계없이 iPSC 유래 심근 세포에 의해 발현되는 NMG-GECO에서 자발적인 칼슘 진동의 관찰이 비디오에서 입증됩니다. MNG-GECO를 사용하여 얻은 운동 추적은 작은 분자 이온 채널 억제제 인 베라파밀, 도페틸 라이드 및 E4031이 예상대로 칼슘 과도 현상에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 표준화되고 진행된 조건 하에서 E4031의 용량 반응을 평가하기 위해 iPSC CM을 발현하는 채널로뎁신-2 및 K-GECO를 1헤르츠 및 470나노미터 펄스의 광을 사용하여 광학적으로 제어하고 적색 K-GECO 신호를 사용하여 관찰했습니다.
피크 진폭의 점진적인 감소 및 칼슘 과도 상태의 붕괴 시간의 증가는 E4031의 농도가 증가함에 따라 발생합니다. E4031의 용량 의존적 효과는 피크 진폭의 감소에 대해 가장 분명했습니다. 투명한 칼슘 과도 현상은 바이러스 형질도입 후 한 달 동안 또는 광학 페이싱에 사용되는 추가 광 없이 계속 볼 수 있습니다.
그래프는 LVNC iPSC CM 모드에서 박동 속도를 증가시키고 수축 간격을 규칙화하며 과도 칼슘 진폭을 증가시키는 것으로 보이는 약물을 보여줍니다. 박동 빈도의 가변성 및 칼슘 과도 기간에 대한 후속 영향도 iPSC CM이 배양에서 유지됨에 따라 변경됩니다. ER LAR-GECO, MTG-SEPIA 및 NIR-GECO를 포함한 여러 GECI는 각각 소포체, 근핵 세망, 미토콘드리아 및 세포질에서 발생하는 실시간 칼슘 활성 측정을 위해 세포 모델에서 단독으로 또는 조합하여 발현하기 위해 개발되었습니다.
GECI는 iPSC CM 모델에서 결합하여 다양한 세포 내 칼슘 저장소를 연구 할 수 있습니다. K-GECO 발현 심근 세포는 시간이 지남에 따라 일관된 박동 거동을 보였다. 그러나 Fluo-4 로딩은이 모델의 비트 주파수와 CTD 모두에 영향을 미쳤으며, 이는 Fluo-4 자체가 그러한 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.
자사는 대조군 및 환자 유래 세포에서 표현형 프로파일을 연구하는 간단한 방법을 제공하는 반면, iPSC 중간체는 다양한 질병에서 약물 발견에 빛을 비출 수 있습니다.
