חיידקי המעיים יכולים להשפיע על תהליכים פיזיולוגיים מרובים של פונדקאים חרקים. הכנה ושמירה על זחלים אקסניים היא כלי רב עוצמה לחקר תפקודי חיידקי המעיים. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם שתרבית רקמה צמחית משמשת להשגת עלים נטולי חיידקים לגידול חרקים אוכלי עלים אקסניים שמקורם בביצים מעוקרות על פני השטח, וכי שיטה זו אינה מוגבלת על ידי דיאטות מלאכותיות.
שיטה זו נוחה ומגבירה את הנראות של שמירה על חרקים אקסניים למחקרים עתידיים על חיידקי מעיים, במיוחד עבור חרקים שאינם מדגמים ללא תזונה מלאכותית מפותחת היטב. שמרו על אוכלוסיית P.versicolora בתא גידול בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו-70% לחות יחסית, עם אור של 16 שעות ופוטופריוד כהה של שמונה שעות. מניחים את החרקים בקופסאות פלסטיק מחוררות עם נייר ספיגה רטוב מוטה, ומאכילים אותם בענפי צפצפה טריים.
מרססים מים נקיים על נייר סופג כדי לשמור על הלחות, ומחליפים את הענפים כל יומיים. מבודדים את הבוגרים לצורך הימצאותם לאחר ההדבקה, ומאכילים אותם בעלים רכים כדי להשיג יותר ביצים. תוך 24 שעות, אספו ביצים שזה עתה הוטלו והניחו אותן על נייר סופג לח למשך 60 שעות כדי להכין זחלים אקסניים.
הכינו טרשת נפוצה בינונית במיליגרם אחד למיליליטר חומצה אצטית אלפא-נפטלין או תמיסות מלאי NAA. במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תמיסת הסטוק של NAA ל-500 מיליליטרים של מדיום טרשת נפוצה, וניערו כדי לערבב היטב. לאחר מכן יוצקים כ -50 מיליליטרים לכל מיכל תרבית רקמה ומחכים להתמצקות.
לעקר אזמלים ומלקחיים בלהבת מנורת אלכוהול במכסה המנוע של בטיחות ביולוגית. חותכים מקטעי גבעול של שלושה עד ארבעה סנטימטרים עם ניצני אפיקל או ניצנים לרוחב משתילי צפצפה בערך חודש אחד של צמיחה, ומכניסים אותם למדיום התרבית, מקטע גזע אחד או שניים לכל מיכל. דגירה של מקטעי גזע אלה בתא גידול למשך כ-30 יום.
והשתמש בעלים נטולי חיידקים אלה כדי להאכיל את הזחלים האקסניים. כלי פטרי אוטוקלאב, מברשות צבע, נייר פילטר, מים מזוקקים בצלחת פטרי המכילה מדיום אגר LB. מניחים עלים עם ביצים דביקות בצלחת פטרי.
לאחר מכן מסירים בזהירות את הביצים מהעלים באמצעות מלקחיים ומעבירים אותן לצלחת פטרי אחרת. שטפו את הביצים האלה עם 75% אתנול במשך שמונה דקות. לאחר מכן יש לחזור על הכביסה ארבע פעמים עם מים סטריליים.
מעבירים את הביצים למדיום אגר LB כדי לשמר את הלחות לבקיעה. מניחים את צלחת הפטרי בתא גידול ומחכים שהביצים יבקעו תוך 24 שעות. במכסה מנוע עם בטיחות ביולוגית, מרצפים שלוש פיסות נייר פילטר רטוב בצלחת פטרי, ומניחים עלי צפצפה נטולי חיידקים על הנייר.
לאסוף את הזחלים ולהניח אותם על העלים. אוטמים את צלחת הפטרי בפארפילם, ומדגרים אותה בתא גידול. החליפו את העלים כל יומיים.
עבור הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי, מעבירים את הביצים מהעלים לצלחת פטרי המכילה נייר סינון לח, ומאכילים את הזחלים האלה בעלים צפצפה נטולי חיידקים. בחרו באופן אקראי שלושה זחלי כוכב ראשון, שני ושלישי מתוך הקבוצות נטולות הנבטים והמגודלות באופן קונבנציונלי. נתחו את הזחלים השלישיים עם מספריים ומלקחיים סטריליים תחת מיקרוסקופ סטריאו, ואספו את המעיים שלהם בצינורות מיקרו-סנטריפוג'.
אספו זחלי כוכב ראשון ושני שלמים בצינורות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS ושלושה כדורי פלדה לצינורות ה-1.5 מיליליטר, וטוחנים את הרקמות להומוגנאטים באמצעות הומוגנייזר מכה חרוזים. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של ההומוגנט ל-LB אגר בינוני וצלחת באמצעות מוט התפשטות זכוכית סטרילי.
הדגירה של הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן התבונן במושבות החיידקים. חלץ את סך הדנ"א של הרקמות שהתקבלו בעבר באמצעות ערכת מיצוי DNA, ומדוד את ריכוז הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר.
הגבר את הגן החיידקי 16S rRNA באמצעות פריימרים אוניברסליים של 16S rRNA עם PCR, והגדר את התגובה כמתואר בכתב היד של הטקסט. אחסן את מוצרי ה-PCR בארבע מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. ערבבו את מוצרי ה-PCR עם צבע חומצת גרעין ונתחו אותם באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1% ב-1X TAE buffer.
השתמש ב-10 מיקרוליטרים של סמן DNA כהפניה. שימו לב לג'ל עם טרנסילומינטור UV, וחפשו את שבר המטרה סביב 1, 500 זוגות בסיסים. אף על פי שלא נצפו מושבות חיידקים בשום קבוצה נטולת חיידקים, הן נצפו בכל הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי, מה שמעיד על כך שזחלים מביצים מעוקרות שניזונו מעלי צפצפה בתרבית רקמה לא הכילו חיידקים.
1, 500 רצועות PCR זוג בסיס הופיעו בכל הקבוצות שגודלו באופן קונבנציונלי. לעומת זאת, לא נצפתה רצועה בקבוצות נטולות הנבטים או בשליטה השלילית, מה שמרמז על כך שלא היו קיימים חיידקי מעיים בזחלים האקסניים. עבור מיני חרקים עם ביצים זעירות, יש להתאים את סוגי חומרי החיטוי ומשך העיקור.
בנוסף, אנדופיטים בצמחים מתרבית רקמה צריכים להיות בולטים. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לשמירה על חרקים נטולי חיידקים, שהיא כלי שימושי להקלה על מחקרי אינטראקציה בין חרקים למעיים, במיוחד עבור חרקים שאינם מודלים ללא דיאטות מלאכותיות מפותחות היטב.
