As bactérias intestinais podem afetar múltiplos processos fisiológicos de hospedeiros de insetos. Preparar e manter larvas axenic é uma ferramenta poderosa para estudar as funções das bactérias intestinais. As principais vantagens deste protocolo são que a cultura do tecido vegetal é usada para obter folhas livres de germes para a folha de axenic traseira que come insetos derivados de ovos esterilizados pela superfície, e que este método não é restrito por dietas artificiais.
Este método é conveniente e aumenta a visibilidade da manutenção de insetos machados para futuros estudos de bactérias intestinais, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas. Mantenha a população de P.versicolora em uma câmara de crescimento a 27 graus Celsius e 70% de umidade relativa, com uma luz de 16 horas e oito horas de fotoperíodo escuro. Coloque os insetos em caixas de plástico perfuradas com papel absorvente molhado inclinado e alimente-os galhos de álamo frescos.
Pulverize a água limpa no papel absorvente para manter a umidade e troque os galhos a cada dois dias. Isole os adultos para oviposition após a pupação, e alimente-os folhas macias para obter mais ovos. Dentro de 24 horas, colete ovos recém-colocados e coloque-os em papel absorvente úmido por 60 horas para preparar larvas axenic.
Prepare o meio MS em um miligrama por ácido acético alfa-naftalen ou naa. Em um capô de biossegurança, adicione 50 microliters da solução de estoque NAA a 500 mililitros de ms médio, e agite para misturar bem. Em seguida, despeje aproximadamente 50 mililitros por recipiente de cultura tecidual e aguarde a solidificação.
Esterilizar bisturis e fórceps em uma chama de lâmpada de álcool no capô da biossegurança. Corte segmentos de haste de três a quatro centímetros com botões apical ou botões laterais de mudas de álamo em aproximadamente um mês de crescimento, e insira-os no meio de cultura, um ou dois segmentos de haste por recipiente. Incubar esses segmentos de haste em uma câmara de crescimento por aproximadamente 30 dias.
E use essas folhas sem germes para alimentar as larvas axenic. Autoclave placas de Petri, pincéis de tinta, papel filtro, água destilada em uma placa de Petri contendo meio ágar LB. Coloque folhas com ovos aderentes em uma placa de Petri.
Em seguida, remova cuidadosamente os ovos das folhas usando fórceps e transfira-os para outra placa de Petri. Lave esses ovos com 75% de etanol por oito minutos. Em seguida, repita a lavagem quatro vezes com água estéril.
Transfira os ovos para o meio ágar LB para preservar a umidade para eclodir. Coloque a placa de Petri em uma câmara de crescimento e espere os ovos chocarem dentro de 24 horas. Em um capuz biossegurança, ladrilho três pedaços de papel filtro molhado em uma placa de Petri, e coloque folhas de álamo sem germes no papel.
Pegue as larvas e coloque-as nas folhas. Sele a placa de Petri com Parafilm, e incuba-a em uma câmara de crescimento. Troque as folhas a cada dois dias.
Para os grupos criados convencionalmente, transfira os ovos das folhas para uma placa de Petri contendo papel filtro úmido, e alimente essas larvas com folhas de álamo sem germes. Selecione aleatoriamente três primeira, segunda e terceira larva instar dos grupos sem germes e convencionalmente criados. Disseque a terceira larva instar com tesouras estéreis e fórceps sob um microscópio estéreo, e colete suas entranhas em tubos de microcentrifuuge.
Coletar larvas intactas primeiro e segunda instar em tubos. Adicione 100 microliters de PBS e três bolas de aço aos tubos de 1,5 mililitro, e triture os tecidos em homogeneizadores usando um homogeneizador de batida de contas. Adicione 100 microliters do homogeneizar ao meio de ágar LB e placa usando uma haste de difusão de vidro estéril.
Incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. Então observe as colônias bacterianas. Extrair o DNA total dos tecidos obtidos anteriormente usando um kit de extração de DNA, e medir a concentração de DNA com um espectrômetro.
Amplie o gene rna 16S bacteriano usando primers universais de rRNA 16S com PCR, configurando a reação conforme descrito no manuscrito do texto. Armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius até uma análise mais aprofundada. Misture os produtos PCR com corante ácido nucleico e analise-os usando eletroforese em um gel de 1% de agarose no tampão TAE 1X.
Use 10 microliters de um marcador de DNA como referência. Observe o gel com um transilluminador UV, e procure o fragmento de destino em torno de 1.500 pares de base. Embora nenhuma colônia bacteriana tenha sido observada em qualquer grupo livre de germes, elas foram observadas em todos os grupos criados convencionalmente, indicando que larvas de ovos esterilizados que eram alimentados com tecidos cultivados com folhas de álamo não continham bactérias.
As 1.500 bandas pcr de par base apareceram em todos os grupos criados convencionalmente. Em contraste, nenhuma banda foi observada nos grupos livres de germes ou no controle negativo, implicando que não existiam bactérias intestinais em larvas axenicas. Para espécies de insetos com ovos minúsculos, os tipos de desinfetantes e duração da esterilização precisavam ser otimizados.
Além disso, os endófitos em plantas cultivadas por tecidos devem ser notáveis. Este protocolo fornece um novo método para manter insetos livres de germes, que é uma ferramenta útil para facilitar estudos de interação entre insetos e intestinos, especialmente para insetos não-modelos sem dietas artificiais bem desenvolvidas.
