Кишечные бактерии могут влиять на многочисленные физиологические процессы насекомых-хозяев. Подготовка и поддержание аксиновых личинок является мощным инструментом для изучения функций кишечных бактерий. Основные преимущества этого протокола заключаются в том, что культура растительной ткани используется для получения листьев без микробов для выращивания аксеновых листьев, поедающих насекомых, полученных из поверхностно-стерилизованных яиц, и что этот метод не ограничен искусственными диетами.
Этот метод удобен и повышает видимость поддержания топорных насекомых для будущих исследований кишечных бактерий, особенно для немодельных насекомых без хорошо разработанных искусственных диет. Поддерживайте популяцию P.versicolora в камере роста при 27 градусах Цельсия и 70% относительной влажности, с 16-часовым светом и восьмичасовым темным фотопериодом. Поместите насекомых в перфорированные пластиковые коробки с наклонной влажной впитывающей бумагой и кормите их свежими ветками тополя.
Распыляйте чистую воду на впитывающую бумагу для поддержания влаги и меняйте ветви каждые два дня. Изолируйте взрослых для яйцекладки после окукливания и кормите их нежными листьями, чтобы получить больше яиц. В течение 24 часов соберите вновь отложенные яйца и поместите их на влажную впитывающую бумагу на 60 часов, чтобы подготовить личинок аксениса.
Готовят MS-среду в одном миллиграмме на миллилитр альфа-нафталина уксусной кислоты или растворах NAA. В вытяжку биобезопасности добавьте 50 микролитров раствора NAA к 500 миллилитрам среды MS и встряхните, чтобы хорошо перемешать. Затем насыпьте примерно 50 миллилитров на контейнер для культуры ткани и дождитесь затвердевания.
Стерилизуйте скальпели и щипцы в пламя спиртовой лампы в капюшоне биобезопасности. Три-четыре сантиметровых стеблевых сегмента с верхушечными почками или боковыми почками из рассады тополя примерно за один месяц роста и вставьте их в культуральную среду, один или два стеблевых сегмента на контейнер. Инкубируйте эти сегменты стебля в камере роста в течение примерно 30 дней.
И используйте эти листья без зародышей, чтобы кормить личинок аксена. Автоклавные чашки Петри, кисти для краски, фильтровальная бумага, дистиллированная вода в чашке Петри, содержащей агаровую среду LB. Поместите листья с прилипшими яйцами в чашку Петри.
Затем аккуратно извлеките яйца из листьев с помощью щипцов и перенесите их в другую чашку Петри. Вымойте эти яйца с 75% этанолом в течение восьми минут. Затем повторите промывку четыре раза стерильной водой.
Переложите яйца на агаровую среду LB, чтобы сохранить влагу для вылупления. Поместите чашку Петри в камеру роста и подождите, пока яйца вылупятся в течение 24 часов. В вытяжке биобезопасности выложите три куска влажной фильтровальной бумаги в чашку Петри и поместите на бумагу листья тополя без микробов.
Соберите личинок и поместите их на листья. Запечатайте чашку Петри парапленкой и высиживайте ее в камере роста. Меняйте листья каждые два дня.
Для традиционно выращенных групп перенесите яйца из листьев в чашку Петри, содержащую влажную фильтровальную бумагу, и кормите этих личинок листьями тополя без микробов. Случайным образом выберите трех первых, вторых и третьих звездных личинок из свободных от микробов и традиционно выращенных групп. Рассекните личинок третьей звезды стерильными ножницами и щипцами под стереомикроскопом и соберите их кишки в микроцентрифужные трубки.
Собирайте неповрежденных личинок первой и второй звезды в трубки. Добавьте 100 микролитров PBS и три стальных шарика в 1,5-миллилитровые трубки и измельчите ткани в гомогенаты с помощью гомогенизатора бисерного взбивания. Добавьте 100 микролитров гомогената в агаровую среду LB и пластину с помощью стерильного стеклянного разбрасывающего стержня.
Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем наблюдают за бактериальными колониями. Извлеките общую ДНК ранее полученных тканей с помощью набора для экстракции ДНК и измерьте концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
Амплифицируйте бактериальный ген 16S рРНК с помощью универсальных праймеров 16S рРНК с ПЦР, настраивая реакцию, как описано в текстовой рукописи. Храните продукты ПЦР при четырех градусах Цельсия до дальнейшего анализа. Смешайте продукты ПЦР с красителем нуклеиновых кислот и проанализируйте их с помощью электрофореза на 1% агарозном геле в буфере 1X TAE.
Используйте 10 микролитров ДНК-маркера в качестве эталона. Понаблюдайте за гелем с помощью УФ-трансиллюминатора и найдите целевой фрагмент около 1 500 пар оснований. Хотя никаких бактериальных колоний не наблюдалось ни в одной группе, свободной от микробов, они наблюдались во всех традиционно выращенных группах, что указывает на то, что личинки из стерилизованных яиц, которые питались тканевыми культивируемыми листьями тополя, не содержали бактерий.
1 500 базовых пар ПЦР-полос появились во всех традиционно выращенных группах. Напротив, в группах, свободных от микробов, не наблюдалось ни одной полосы или отрицательного контроля, что подразумевает, что в личинках аксении не существовало кишечных бактерий. Для видов насекомых с крошечными яйцами необходимо оптимизировать виды дезинфицирующих средств и продолжительность стерилизации.
Кроме того, эндофиты в тканевых культивируемых растениях должны быть заметными. Этот протокол обеспечивает новый метод поддержания насекомых без микробов, который является удобным инструментом для облегчения исследований взаимодействия насекомых и кишечных бактерий, особенно для немодельных насекомых без хорошо разработанных искусственных диет.
