הבידוד של פטריות אנטומופתוגניות הוא משמעותי לפיתוח ביו-פסטיקיד ויכול להיות מועיל לחקר המגוון, התפוצה והאקולוגיה של קבוצה מסוימת זו. שימוש בפיתיונות חרקים כדי לבודד פטריות אנטומופתוגניות נחשב לשיטה זולה ויעילה ביותר. כלוראמפניקול, תיאבנדזול, ציקלוהקסימיד, מדיה מלאכותית אינה משתמשת בדודין ודורשת פחות מקום בתהליך דגימת הקרקע.
שלבים קריטיים כוללים חקר לוחות CTC לאחר שבוע ושבועיים כדי למנוע מפטריות אחרות להצטמצם ולאנטומופתוגניות של פטריות בהתפתחותן, ולאחר מכן זיהוי מושבות פטריות אנטומופתוגניות על סמך המורפולוגיה של המאקרו והמורפולוגיה המיקרו-מורפולוגית שלהן. התחילו באיסוף 800 גרם אדמה לעומק של 10 סנטימטרים באמצעות חפירה קטנה. אחסנו את הדגימות בשקיות פוליפרופילן בטמפרטורת החדר עד לתחילת הניסוי.
ניתן גם לאסוף שורשים קטנים מכיוון שידוע כי פטריות אנטומופתוגניות הן בעלות יכולת ריזוספרה. לבידוד פטריות באמצעות כלוראמפניקול, תיאבנדזול, ציקלוהקסימיד או תווך מלאכותי סלקטיבי CTC, שוקלים 0.35 גרם מדגימת הקרקע עם או בלי שורשים. מקם דגימה זו במיקרו-צינורית של 1.5 מיליליטר.
תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו מיליליטר אחד של תרחיף מימי סטרילי בנפח 0.01 אחוז פוליאוקסיאתילן סורביטן מונואולאט למיקרו-צינורית המכילה אדמה ומערבולת את הצינור למשך 30 שניות. כאשר נעשה להסיר פיפטה 50 microliters של supernatant על מרכז של צלחות פטרי עם מדיום CTC. לאחר מכן השתמש במרית דריגלשסקי סטרילית בקוטר שישה מילימטרים כדי לפזר באופן הומוגני את ההשעיות על פני השטח של המדיום.
דגירה של הלוחות בתאי האקלים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית מינימלית של 80% בחושך. לאחר שבעה, 14 ו -21 ימים של דגירה, שימו לב ללוחות לצמיחת מושבות פטרייתיות. כדי לבודד את הפטריות באמצעות משטח מחוטא גלריה mellonella ו Tenebrio molitor זחלים בשלב מאוחר כמו פיתיונות חרקים.
טבולים את הזחל ב-0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת לצורך עיקור. לאחר מכן לשטוף את הזחלים פעמיים עם מים סטריליים. הרכיבו את הפיתיונות בסירי פלסטיק עם 10 חורים קטנים בקוטר 10 מילימטר במכסה המכיל 250 גרם של האדמה שנאספה.
הומוגניזציה של האדמה כל יומיים כדי לאפשר מגע מקסימלי של זחלים עם אדמה ולנתח את העציצים מדי יום, בחיפוש אחר חרקים מתים. לאחר הסרת חרקים מתים מהסיר, מעקרים באופן שטחי חרקים עם 0.5% נתרן היפוכלוריט למשך דקה אחת. כדי להעדיף את המיקוזיס, למקם את החרקים הסטריליים בתא לח ב 80% לחות יחסית ו 25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.
על מיקוזיס, לקצור את הקונידיה מפני השטח של החרקים ובעזרת הלולאה המיקרוביולוגית, למקם את הקונידיה על מדיום אגר דקסטרוז תפוחי אדמה המכיל 0.05% כלורמפניקול או מדיום PDAC תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. כחלופה, הניחו את כל הזחלים הנגועים על מדיום ה-PDAC. ולדגום את לוחות התרבות בתא אקלים כפי שהוסבר קודם לכן.
לאחר 14 ימי דגירה, זהה את מיני ה-EPF על ידי ניתוח המאפיינים המורפולוגיים של המאקרו של תרבויות הפטריות על הלוחות כפי שמתואר בכתב היד. לאחר מכן מעבירים את הקונידיה האווירית לתרביות החלקה למשך שלושה ימים בלחות יחסית של 80% וב-25 מעלות צלזיוס. לאחר שלושה ימים מכתימים את המגלשה בכחול לקטופנול כדי להתבונן בתכונות המיקרוסקופיות.
תחת מיקרוסקופ אופטי, התבונן במבנים הפטרייתיים כגון סידור, קונידיופורים, צורה וגודל של קונידיה פי 400 ואישר את זיהוי ה- EPF. במחקר, 51 זני EPF של מיני Metarhizium ו-Beaveria בודדו מ-524 דגימות קרקע. הניתוח הייצוגי מראה את המאפיינים המיקרומורפולוגיים של כמה מבודדים של מיני Metarhizium ומיני Beaveria.
הופעת EPF ב -24 דגימות הקרקע נחקרה באמצעות שלוש שיטות שונות של בידוד. פיתיון גלריה מלונלה התגלה כיעיל יותר בבידוד, ואחריו פיתיון מוליטור טנבריו ומדיום CTC. אותן 24 דגימות קרקע לא הראו התאוששות של מיני ביבריה, אלא רק של מטא-ריזיום.
הדברים החשובים ביותר שיש לזכור הם העברת הקונידיה האווירית לציפוי החלקה תוך התבוננות בתכונות המיקרוסקופ ואישור זיהוי הפטריות האנטומופתוגניות באמצעות מקשים מורפולוגיים. שיטות נוספות כוללות שימוש במדיה מלאכותית סלקטיבית אחרת עם כימיקלים ספציפיים כדי להפחית את הצמיחה של מזהמים כגון dodine. חיפוש אחר מבודדים פטרייתיים חדשים עם תכונות הדברה ביולוגית יוצאות דופן הוא חיוני להגברת היעילות של פטריות בהדברת פרוקי רגליים ולחקור שאלות נוספות בתחום הפתולוגיה של חסרי החוליות.
