הנתונים שהוצגו במחקר זה מראים את ההשפעות הדרמטיות של חסימת שופכה חד צדדית על תפקוד הכליות, דלקת ופיברוזיס. זה עוזר לנו להבין את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של חסימת שופכה חד צדדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לחקור אינטראקציות בין תאים, אירועים תת-תאיים, ולקשר מבנה ותפקוד באופן דינמי בתוך כליה מתפקדת.
הדגמת הליך השופכה תיעשה על ידי ד"ר סילביה קמפוס-בילדרבק שהיא מנתחת במעבדתנו. כדי להתחיל, להרדים את החולדה, ולאחר מכן לבצע חתך לאורך קו האמצע ולאתר את הכליה השמאלית כדי להפריד אותה מאיברי הצפק שמסביב. לאחר איתור פדיקל הכליה, הכולל את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, מפרידים את השופכן מבלי לפגוע במבנה העדין.
השתמש מלקחיים כדי לולאה ולקשור תפר 3-0 סביב השופכן, ולאחר מכן לקשור קשר כמה מילימטרים משני צדי הקשר הראשון כדי להבטיח חסימה מוחלטת. ברגע שהשופכן קשור, סגור בזהירות את שכבות השרירים העוקבות, ולאחר מכן סגור את הבטן לחלוטין. סגור את העור החיצוני עם סיכות כירורגיות.
להכנה כירורגית, הניחו את החולדה המורדמת עם קו גישה ורידי שוכן בצד כאשר האגף השמאלי המגולח פונה כלפי מעלה שטוח וישר על השולחן. ודאו שהכפות הקדמיות של החולדה נוגעות זו בזו וכך גם הכפות האחוריות. לאחר מיקום החולדה, מישוש את האגף השמאלי ממש מתחת לצלעות כדי להרגיש את הכליה ולקבוע את המיקום הטבעי בבטן, ולאחר מכן צייר קו באמצעות סמן קבוע לאורך האזור המגולח, חוצה את מרכז הכליה בכיוון האף אל הזנב.
השתמש בזוג מלקחיים משוננים כדי לתפוס ולהרים את העור כלפי מעלה ולצבוט את קו הסימון הקבוע עם זוג המוסטאטים כדי לרסק את כלי הדם שמתחת ולמנוע דימום. חזור על ההליך עבור שכבת השריר החיצוני הדק כדי למזער את הדימום. כדי לבצע את החתך הסופי של שכבת שריר הבטן הפנימית הדקה, למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל והמיקום ולהרים את שכבת השריר הפנימית עם זוג מלקחיים, ולאחר מכן למחוץ קו החוצה את העור מעל הכליה עם hemostats כי הוא בערך 1/3 את הגודל המשוער של הכליה.
תוך שמירה על האחיזה בשכבת השריר עם המלקחיים, בצע את החתך הסופי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים בכל יד כדי לאחוז ולהחזיק את שומן הכליות בקוטב התחתון של הכליה בטכניקת יד ביד הפועלת כלפי מטה. לאחר אחיזה איתנה על השומן ביד אחת, למשוך את השומן בעדינות רבה לסחוט את הכליה דרך החתך.
אם הכליה לא עוברת, בקלות להרחיב את החתך. כדי לזהות את תאי הדם הלבנים או ה-WBCs שנתקעו בלולאות הנימיות, יש לתת את הכתם הגרעיני של Hoechst 33342 ב-8 מיקרוגרם לקילוגרם של משקל חולדה דרך קו גישה ורידי שוכן. במיקרוסקופ, מניחים את הכליה החשופה על קצה המנה בסיבוב קל כך שצד הבטן של הכליה יוצר מגע עם החלק המכסה והצד הגבי פונה הרחק מהקצה.
כדי למזער עוד יותר את התנועה, לארוז שתי רפידות גזה סטריליות 2 על 2 רטוב עם מלוחים נגד הצד הגבי של הכליה מחזק את המגע של הצד הבטן של הכליה לקצה. כאשר הדגימה ממוקמת, התבונן דרך עינית המיקרוסקופ תחת תאורת אפיפלואורסצנציה באמצעות קוביית רודמין FITC בעלת מעבר כפול. אם מזוהה תנועה במצב הדגימה, בצע התאמות קלות על ידי התאמת הגזה כדי להבטיח שהיא לא תדחוף מתחת לכליה.
מגלגלים מעט את החולדה כך שבית החזה יהיה רחוק יותר מהמנה. סרוק את פני הכליה באמצעות תאורת אפיפלואורסצנציה וסמן את מיקומי הגלומרולי באמצעות התוכנה המשויכת לבקר הבמה הממונע. עבור כל ערוץ צבע תחת תאורת 2 פוטונים, צלם נפח תלת-ממדי רדוד של החלק העליון של כל גלומרולוס מסומן כדי לשמש כתמונת הרקע.
באפשרות התצוגה של תוכנת ההדמיה, השתמש בלוח צבעים פסאודו כדי לדמיין את העוצמות הקלושות של פלואורסצנטיות הרקע של הלולאות הנימיות הגלומרוליות. באמצעות כלי דם שטחי כנקודת המוקד, להחדיר באיטיות את אלבומין סרום טקסס רד ראפ או TRRSA תוך התבוננות בעלייתה ונפילתה של פלואורסצנציה עקב ההתפלגות המערכתית עד שעוצמה בכלי הדם הפריטובולאריים ולולאות נימי היא ממש מתחת לרוויה. לאחר 10 דקות, רכשו נפחים תלת-ממדיים עבור כל הגלומרולי המסומנים והמצולמים במרווחים של 1 מיקרומטר.
מצאו כלי מתאים, לולאה נימית או כלי פריטובולרי, ולאחר מכן סובבו את התמונה באמצעות פונקציית הסיבוב, שכן פונקציית סריקת הקו בתוכנת רכישת התמונה דורשת שהכלי יהיה בניצב. לאחר סיבוב הספינה ושכיבה שטוחה, בחר את פונקציית XT בתפריט רכישה והגדר אותה לסריקה של 4, 000 שורות. מניחים את הקו לרוחב הכלי כדי להיבדק עם מישור המוקד בקוטר המרבי של המקטע.
לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על התמונה ללא הפרדות צבע ובחר בכרטיסייה צלם תמונה כדי ליצור תמונת הפניה של האזור שבו צולמה סריקת הקו. לחץ מיד על התחלה כפתור כדי ללכוד את סריקת הקו של הספינה. מאוחר יותר, ייבא את סריקות הקווים לתוכנת עיבוד התמונה כדי לקבוע את קצב הזרימה של RBC.
תחת התפריט הנפתח מדידה, פתח את תיבת הדו-שיח הצג סטטיסטיקה של אזור ובחר בכלי ציור קו בודד כדי לצייר קו התואם לשיפוע של צללי RBC. לאחר ציון הרוחב והגובה של הקו, השתמש במשוואה כדי לחשב את המהירות, ולאחר מכן קבל ממוצע של חמישה חישובים כדי לדווח על המהירות עבור כל סריקת שורה. מרכזו גלומרולוס בתחום ההדמיה וקחו סט נתונים תלת-ממדי המתחיל במשטח הגלומרולרי ומסתיים ב-30 עד 35 מיקרומטר.
השתמש בגודל צעד של 1 מיקרומטר בכיוון Z. זהה את ה- WBCs על ידי השוואת ערוץ Hoechst הכחול עם ערוץ האלבומין האדום של טקסס על ידי חיפוש הרחקה של צבע אדום בלולאה הנימית וכתם גרעיני מתאים. אם ה- WBC נראה סטטי על פני שלושה מקטעים אופטיים, הגדר את התאים כדבוקים, ולאחר מכן דווח על הערכים כמופע לכל 10 מקטעים אופטיים מראש הגלומרולוס שצולמו במרווחים של 1 מיקרומטר.
מספר הגלומרולרים לכל שדה בחולדות Wistar Fromter או MWF במינכן הוגדל בקבוצת UUO במשך 5 שבועות מאשר בחולדות שלא טופלו. חולדות ספראג-דאולי, או חולדות SD, עברו ממצב ללא גלומרולי משטח ל-2.02 לכל שדה לאחר חמישה שבועות של חסימת שופכה חד-צדדית. תמונות משוחזרות תלת מימדיות נצפו כדי להציג את פני הכליה.
חסימת השופכה החד-צדדית בת 5 שבועות בחולדות SD לא גרמה לאזורים הדומים לאפיתליה צינורית רגילה כפי שניתן לראות בחולדות MWF, לא מטופלות, ובחלקן בחולדות UUO MWF בנות 5 שבועות. במחקר של הדינמיקה הכלית של כלי הדם, זרימת הדם הכלייתית הופחתה באופן משמעותי בקבוצות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות שלא טופלו. מהירות ה-RBC בתוך הלולאות הנימיות הגלומרולריות ירדה משמעותית בחולדות UUO MWF ו-SD במשך 5 שבועות, בהשוואה לחולדות MWF שלא טופלו.
בנוסף, לחולדות MWF שלא טופלו היו פחות WBC לכל 10 מקטעים אופטיים מלמעלה, בעוד שהמספר גדל בחולדות UUO MWF של 5 שבועות וחולדות UUO SD של 5 שבועות. עם חסימת שופכה חד צדדית, נצפתה עלייה בחדירות אלבומין. הצטברות אלבומין בחלל באומן הייתה אינטנסיבית לאחר חסימת שופכה חד צדדית.
מקטע S1 אנדוציטוזה כמויות גדולות של אלבומין כפי שנצפה עם מצבים פיזיולוגיים בחולדות MWF שלא טופלו. לא ניתן היה לראות את אותה קליטה בחולדות MWF או SD לאחר 5 שבועות של חסימת שופכה חד צדדית. שיטות רבות ושונות כגון הדמיה חוזרת כדי לחקור תהליך לאורך זמן, קיבוע של אזור מסוים להדמיה, ולאחר מכן ניצול של הרקמה הקבועה כדי לבצע מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה יותר יכול להיעשות בשילוב עם טכניקה זו.
הטכניקה נחשבת לטכנולוגיה משבשת. הוא מאפשר לחוקרים לענות על שאלות חדשות רבות. בכך סופקו תובנות חדשות והתקבלו נתונים משנים פרדיגמה.
