המטרה הכללית של הסרטון הבא היא להדגים את השימוש בספרייה האפיגנטית של shRNA לצורך ביצוע הקרנה שלילית של בחירה. סינון זה מאפשר לזהות מטרות אפיגנטיות ספציפיות באמצעות ריצוף. הליך זה יכול לסייע בזיהוי הגורמים האפיגנטיים האחראים לתיווך עמידות ציטרבין נרכשת ב- AML הצעדים הם כדלקמן.
בחירה של המקדם החזק ביותר כדי לקבל ביטוי מתמשך וממושך של shRNAs. הפרוטוקול הנוכחי מתמקד בסינון RNAi באמצעות ספריית shRNA של גורמים אפיגנטיים בקו תאים MV4-11 עמיד לציטרבין. היזמים המשמשים למטרה זו הם EF-1 אלפא אנושי, CMV אנושי ו- SFFV, מקדמים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק.
קח את ספירת התאים באמצעות שיטת אי הכללה כחולה של טריפאן. השהה את התאים במדיום 10% RPMI המכיל 8 מיקרוגרם לפוליברן מ"ל. זרע 1 מיליון תאים ב-1.5 מ"ל של בינוני לבאר של צלחת של שש בארות במשולש.
הוסף כרכים שונים של lentiviruses מרוכזים. לדוגמה, lentiviruses, לדוגמה, 10, 20, ו 40 microliter, תלוי titer של lentiviruses לכל באר. סובבו בעדינות את הצלחת כדי לערבב את התכולה.
בצע ספינפקציה על ידי צנטריפוגה ב 920 גרם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. מיד לדגום את הצלחות בחממת פחמן דו חמצני. התבונן ב- GFP בתום 48 שעות וכימת את אותו הדבר בתום 72 שעות.
לאחר מכן, בצע את השלבים כמתואר בתרשים הזרימה כדי לבחור את המקדם המציג ביטוי GFP עקבי לאורך כל התרבות. הכנת ספריית ה-shRNA של הגורם האפיגנטי האנושי הלאנטי-ויראלי המאוגד. תרבית 293T של תאים במספר מעבר נמוך עם קצב התפשטות טוב בשלוש מנות תרביות תאים של 10 ס"מ עם 8 מ"ל של 10% DMFM בינוני בכל צלחת.
ברגע שהתאים מגיעים ל-60% מפגש, החליפו עם מדיום טרי לחלוטין. הכינו את תערובת הטרנספקציה כמתואר המכילה פלסמיד PAX2 אריזה ללא סרום ללא סרום, פלסמיד אריזה לנטיוויראלי, פלסמיד מעטפת pMD2. G, פלסמידי ספרייה מרוכזים, ולבסוף מגיב הטרנספקציה.
יש להקיש על התערובת כדי לערבב אותה היטב ולדגום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לתאי 293T ומערבבים בעדינות על ידי מערבולת הצלחות. דגירה של הצלחות באינקובטור פחמן דו חמצני.
שנה את המדיום לאחר 24 שעות. לאחר 48 שעות, בדקו אם יש ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח יעילות גבוהה של טרנספקציה לתאי 293T. אספו את חומרי העל של הנגיף לאחר 48, 60 ו-72 שעות ואחסנו אותם ב-4 מעלות, והוסיפו מדיום טרי, 8 מ"ל, בכל נקודת זמן לאחר איסוף הנגיף.
סנן את הווירוסים המאוגדים באמצעות מסנן של 0.4 מיקרון. לקבלת טיטר גבוה של וירוסים, לרכז את הווירוסים המאוגדים על ידי ultracentrifugation. העבר את הווירוס המסונן ל-70 צינורות Ti, וצנטריפוגה ב-18, 000 גרם למשך שעתיים.
השתמש ברוטור וצנטריפוגה מוכנים מראש ב-4 מעלות. מוציאים את הצינורות מהצנטריפוגה בזהירות ומסירים את הסופרנאטנט לחלוטין. יש לבצע החייאה עדינה של הכדור ב-400 מיקרוליטר של DMEM ללא FBS ואנטיביוטיקה באמצעות מיקרופיפט, הדגירה על קרח למשך שעה.
Aliquot את הנגיפים ומקפיאים במינוס 80 מעלות. חשב את ריכוז הנגיף כפי שמוצג. הערכת יעילות ההתמרה של נגיפי הלנטי.
מתמרים תאי 293T עם נגיף מרוכז בכמויות שונות, 2, 4 ו-8, כדי לאשר את ההכנה המוצלחת של נגיף הלנטי. ערך לנגיף מרוכז ל-100X לביצוע ניסוי טיטרציה בקו תאי המטרה. זרע 1 מיליון תאי מטרה קו ב 1.5 מ"ל של 10% RPMI בינוני המכיל 8 מיקרוגרם לכל מ"ל פוליברן בבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות.
הוסף ארבעה כרכים שונים, 1, 1.5, 2, 2.5 מיקרוליטר של וירוסים 100X. בצע ספינפקציה על ידי צנטריפוגה של הלוח ב 920 גרם במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 72 שעות, יש למדוד את אחוז התאים החיוביים ל-GFP לפי ציטומטריה של זרימה.
קבע את נפח הווירוסים כדי להשיג יעילות התמרה של 30%. יעילות התמרה נמוכה זו נועדה להבטיח שילוב של shRNA יחיד לכל תא. התמרה של ספריית ה-shRNA האפיגנטית המשולבת בקו התאים העמידים לתרופות.
חשב את מספר התאים שיילקחו לניסוי כדלהלן בהתבסס על מספר האינטגרנטים הנגיפיים. החייאה של 11 מיליון תאים ב-16 ML של 10% RPMI בינוני. הוסף פוליברן, שמונה מיקרוגרם למ"ל וערבב היטב, ולאחר מכן הוסף את נפח הנגיפים הנדרש כדי לקבל יעילות התמרה של 30% כפי שחושב קודם לכן.
זרעו את כל התאים על צלחת בת שש בארות בצפיפות של מיליון תאים לכל 1.5 מ"ל לבאר. צנטריפוגה על הצלחת במשך 90 דקות ב 920 גרם ב 37 מעלות צלזיוס. דוגרים את הצלחת למשך הלילה באינקובטור פחמן דו חמצני.
לאחר 24 שעות, לשנות את המדיום ולהעביר את התאים המתומרים לבקבוק T-75. לאחר 48 שעות, בדקו את ה-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להבטיח התמרה מוצלחת. לאחר 72 שעות, כמות ה- GFP על ידי ציטומטריית זרימה.
העשרה של התאים החיוביים GFP. הרחב את התאים המתומרים על ידי עיגולם בצפיפות של 0.5 מיליון למ"ל למשך 5 עד 7 ימים, ובצע מיון זרימה עם הגדרת מיון הזרימה שנקבעה כטוהר גבוה ותפוקה נמוכה. תרבית את התאים הממוינים במדיום RPMI של 10%.
לאחר 72 שעות, בצע את ההערכה שלאחר המיון של אחוז התאים החיוביים ל- GFP כדי להבטיח יעילות מיון של יותר מ- 95%. בדיקת נשירה כדי לזהות גורמים אפיגנטיים המתווכים עמידות לתרופות. תרבית את התאים המתומרים בספריית shRNA ב-10% RPMI למשך עד 5 ימים.
צנטריפוגה 10 מיליון תאים בכפילויות. יש להשליך את חומר העל ולאחסן את הכדורים במינוס 80 מעלות. דגימות אלה ישמשו כהפניה הבסיסית לספריית ה-shRNA האפיגנטית.
תרבית את התאים המתומרים הנותרים ככפילויות, R1 ו-R2, שכל אחד מהם נשמר בספירת תאים המספקת ייצוג של פי 500 של הספרייה. לטפל אחד הכפילויות עם התרופה, 10 micromolar cytarabine, והשני ללא הטיפול התרופתי. שנה את המדיום עבור הצלוחיות עם, ובלי התרופה, כל 72 שעות.
חזור על השינוי הבינוני שלוש פעמים עבור חשיפה מצטברת לתרופה של 9 ימים. לאחר היום התשיעי של הטיפול התרופתי, בדוק את הכדאיות של התאים בשיטת ההדרה הכחולה של טריפאן. סובבו את התאים בני הקיימא הנותרים, שטפו עם PBS סטרילי וצנטריפוגה ב-280 גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
השליכו את חומר העל ואחסנו את הכדורים במינוס 80 לצורך מיצוי דנ"א. הגברה של shRNA משולבים על ידי PCR. חילוץ דנ"א מתאי הבסיס המתומרים, התאים המטופלים והלא מטופלים, ולאחר מכן בדיקת הריכוז באמצעות פלואורומטר, מחשבים את כמות הדנ"א הנדרשת כפי שמוצג ומעבירים את הדגימות לסבב הראשון של ה-PCR.
תערובת תגובת ה-PCR מתוארת בטבלה 2 עם תנאי הרכיבה התרמית. הגדר תגובות מרובות המכילות דנ"א של 850 ננוגרם לכל שפופרת בסך הכל עבור 43 תגובות בסך הכל. אגרו את מוצרי ה-PCR וטהרו אותם.
אלקט את המוצרים ב-50 מאגר מיקרוליטר וכימת אותם, ולבסוף, לאחסן במינוס 20. עבור PCR בסיבוב שני, השתמש בפריימרים של אינדקס הפוך והריאגנטים מסומנים בטבלה 4. הגדר ארבע תגובות עם 500 ננוגרם של מוצר ה-PCR העיקרי בנפח תגובה כולל של 50 מיקרוליטר עבור כל דגימה יחד עם הבקרה השלילית.
טען את כל המוצר לאלקטרופורזה באמצעות ג'ל אגרוז 2% TBE ואישר את גודל הרצועה בסולם מולקולה KB אחד. דמיינו את מוצרי ה-PCR במערכת תיעוד הג'ל. הוציאו את הרצועה הספציפית וטהרו באמצעות ערכת טיהור ג'ל.
חישובים לטיהור עם הערכה מסופקים בטבלה 3. Elute בנפח סופי של 30 מיקרוליטר של חיץ אלוטיון עם ריכוז משוער של כל eluent סביב 80 עד 90 ננוגרם לכל מיקרוליטר. הדור הבא של ריצוף וניתוח נתונים.
המוצרים המטוהרים בג'ל עוברים ריצוף מהדור הבא כדי לקבל ספירות קריאה עבור צורכי ה-shRNA המדולדלים. חתוך את רצפי המתאם, יישר את הקריאות המסוננות לרצפי הייחוס, טען את הקבצים באמצעות SAMtools כדי לקבל סיכום יישור. טען את קבצי fastQ החתוכים ב- CRISPRCloud2 ובצע את הניתוח בהתאם להוראות.
לחץ על הקישור שסופק עבור CRISPRCloud2. בחר את סוג המסך כמסכי הישרדות ונשירה. הגדר את מספר הקבוצות והקלד את השם עבור כל קבוצה.
העלה את ספריית ההפניות כתבנית הקובץ FASTA. הנתונים המועלים מעובדים והתוצאות זמינות בכתובת ה-URL הנתונה. נתונים מייצגים.
נתון זה מראה MV4-11 תאים הורים ועמידים שטופלו בריכוז ציטרבין עולה, 0.1 מיקרומולאר עד 1, 000 מיקרומולר והערכת כדאיות על ידי בדיקת MTT. איור זה מציג חלקות זרימה מייצגות של ה-GFP המכומתות על ידי ציטומטריית זרימה בתום 72 שעות עבור מקדמי אלפא EF-1, CMV אנושי ו-SFFV אנושיים. CMV אנושי מראה את השיא ההטרוגני שלנו בעוד ש-EF-1 אלפא ו-SFFV אנושיים מראים שיא הומוגני יחיד.
איור זה מציג את גרף העמודות עבור שלוש היעילויות השונות של מקדם המכירות ב-MV4-11. GFP מונע SFFV הראה השתקה של ה-GFP בתרבות ממושכת. תאי GFP מונעי-אלפא של hEF-1 הראו ביטוי מתמשך לאחר מיון של תאים אלה.
הלוח השמאלי מציג את יעילות הטרנספקציה של ספריית ה-shRNA המאוגנת שעברה טרנספקציה ב-293T בתום 48 שעות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הלוח הימני מציג את יעילות ההעתקה של נגיף הבריכה בתאי 293T עם נפחי וירוסים משתנים, 2, 4 ו-8 מיקרוליטר. נתון זה מייצג את יעילות ההתמרה בקו התאים העמידים ל-MV4-11 עם נפחים משתנים של וירוסים, כמו 1, 1.5, 2, 2.5 מיקרוליטר כדי להשיג יעילות התמרה של 30%.
נתון זה מראה את המיון של התאים החיוביים של GFP עם יעילות התמרה של 30% עם טוהר גבוה וקביעת מיון בתפוקה נמוכה. האיור מציג המחשה סכמטית של טיפול תרופתי בתאים ממוינים חיוביים של GFP לחשיפה ממושכת לציטרבין של 9 ימים, ולאחר מכן בדיקת הכדאיות ואיסוף התאים לדנ"א. איור זה מציג את אזורי הקישור של הפריימר המשמשים בסיבוב הראשון והשני של PCR.
נתון זה ממחיש את גודל הפס של מוצר ה-PCR בסוף הסיבוב הראשון של ה-PCR, זוג הבסיסים 397, וזוג הבסיסים של מוצר ה-PCR בסיבוב השני 399, שעבר ג'ל-eluted, טוהר וניתן עבור NGS. נתון זה ממחיש את הייצוג של ה-shRNA המועשרים או המדולדלים המכוונים לגורמים האפיגנטיים שיכולים לתווך עמידות לציטרבין ב-AML. מסקנה. פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של סינון ממוקד כדי לחקור גנים חיוניים ולא חיוניים באופן שיטתי ומדגים את השימוש בגישה זו כפלטפורמה פונקציונלית, המאפשרת זיהוי של מטרות האחראיות לעמידות לתרופות.
