다음 비디오의 전반적인 목표는 음성 선택 스크리닝을 수행하기 위해 풀링된 shRNA 후성유전학적 라이브러리의 사용을 입증하는 것이다. 이 스크리닝은 시퀀싱을 통해 특정 후성유전학적 표적을 식별할 수 있게 한다. 이 절차는 AML에서 획득된 시타라빈 내성을 매개하는 역할을 하는 후성유전학적 인자를 동정하는 데 도움이 될 수 있으며, 그 단계는 다음과 같다.
shRNAs의 지속적이고 장기간의 발현을 얻기 위한 가장 강력한 프로모터의 선택. 현재의 프로토콜은 시타라빈 내성 MV4-11 세포주에서 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리를 이용한 RNAi 스크리닝에 초점을 맞추고 있다. 이러한 목적을 위해 사용되는 프로모터는 인간 EF-1 알파, 인간 CMV, 및 SFFV, 녹색 형광 단백질을 발현하는 프로모터이다.
트리판 블루 제외 방법을 사용하여 셀 수를 가져옵니다. 세포를 mL 폴리브렌 당 8 마이크로그램을 함유하는 10%RPMI 배지에 현탁시킨다. 6-웰 플레이트의 웰 당 배지 1.5ml에 1백만 개의 세포를 삼중으로 시드한다.
다양한 양의 농축 렌티 바이러스를 추가하십시오. 예를 들어, 렌티바이러스는 예를 들어, 각 웰에 대한 렌티바이러스의 역가에 따라 10, 20, 및 40 마이크로리터이다. 접시를 부드럽게 소용돌이 치며 내용물을 섞는다.
섭씨 37도에서 920g에서 90분 동안 원심분리하여 스파이싱을 수행합니다. 플레이트를 즉시 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 48 시간의 끝에서 GFP를 관찰하고 72 시간의 끝에서 동일하게 정량화한다.
다음으로, 흐름도에 묘사된 바와 같은 단계를 따라 배양 전반에 걸쳐 일관된 GFP 발현을 나타내는 프로모터를 선택한다. 풀링된 렌티바이러스 인간 후성유전학적 인자 shRNA 라이브러리의 제조. 각 플레이트에 10%DMFM 배지 8ml를 갖는 세 개의 10센티미터 세포 배양 접시에서 양호한 증식률을 갖는 낮은 계대 수로 293T 세포를 배양한다.
세포가 60 % 합류율에 도달하면 완전히 신선한 배지로 교체하십시오. 무혈청 배지, 렌티바이러스 패키징 플라스미드 PAX2, 엔벨로프 플라스미드 pMD2를 함유하는 약술된 바와 같이 형질감염 믹스를 준비한다. G, 풀링된 라이브러리 플라스미드, 및 최종적으로 형질감염 시약.
혼합물을 탭하여 잘 혼합하고 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 형질감염 혼합물을 293T 세포에 첨가하고, 플레이트를 소용돌이치면서 부드럽게 혼합한다. 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
24 시간 후에 배지를 변경하십시오. 48시간 후, 293T 세포 내로의 높은 형질감염 효율을 보장하기 위해 형광 현미경으로 GFP 발현을 확인하였다. 48, 60 및 72시간 후에 바이러스 상층액을 수집하여 4도에 보관하고, 바이러스를 채취한 후 각 시점마다 신선한 배지 8ml를 첨가한다.
풀링된 바이러스를 0.4미크론 필터로 필터링합니다. 바이러스의 높은 역가를 얻기 위해, 초원심분리에 의해 풀링된 바이러스를 농축시킨다. 여과된 바이러스 상청액을 70개의 Ti 튜브로 옮기고, 18, 000 g에서 2시간 동안 원심분리한다.
4도에서 미리 냉각 된 로터와 원심 분리기를 사용하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 꺼내어 상층액을 완전히 제거하십시오. 펠렛을 마이크로피펫을 사용하여 FBS 및 항생제 없이 400 마이크로리터의 DMEM에 부드럽게 재현탁시키고, 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
바이러스를 분취하여 영하 80도에서 동결하십시오. 표시된 바와 같이 바이러스의 농도를 계산하십시오. 렌티바이러스의 형질도입 효율의 추정.
293T 세포를 상이한 부피, 2, 4 및 8의 농축된 바이러스로 형질도입하여, 렌티바이러스의 성공적인 제조를 확인한다. 바이러스를 100X로 농축하여 표적 세포주에서 적정 실험을 수행하였다. 시드 1백만 표적 세포주를 6웰 플레이트의 한 웰에 폴리브렌 ml 당 8 마이크로그램을 함유하는 10%RPMI 배지 중 1.5 ml에 시딩한다.
네 가지 볼륨, 1, 1.5, 2, 2.5 마이크로 리터의 100X 바이러스를 추가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 90분 동안 920 g에서 원심분리하여 스파이싱을 수행한다. 72시간 후, 유세포 분석기로 GFP 양성 세포의 백분율을 측정하였다.
바이러스의 부피를 결정하여 30 % 형질 도입 효율을 얻으십시오. 이러한 낮은 형질도입 효율은 세포당 단일 shRNA 통합을 보장하기 위한 것이다. 약물 내성 세포주에서 풀링된 후성유전학적 shRNA 라이브러리의 형질도입.
바이러스 적분의 수를 기준으로 아래와 같이 실험을 위해 취해질 세포의 수를 계산한다. 11 백만 세포를 10 % RPMI 배지 16 ML에 재현탁하십시오. ml 당 여덟 마이크로 그램의 폴리 브렌을 넣고 잘 섞은 다음 필요한 양의 바이러스를 추가하여 이전에 계산 된 30 % 형질 도입 효율을 얻으십시오.
모든 세포를 웰 당 1.5ml 당 1 백만 세포의 밀도로 여섯 웰 플레이트에 시드하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 920 g에서 90분 동안 원심분리한다. 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
24시간 후, 배지를 변경하고 형질도입된 세포를 T-75 플라스크로 옮긴다. 48시간 후, GFP를 형광 현미경으로 확인하여 성공적인 형질도입을 보장한다. 72시간 후, GFP를 유세포 분석기로 정량한다.
GFP 양성 세포의 농축. 형질도입된 세포를 5 내지 7일 동안 ml당 0.5백만의 밀도로 배양하여 확장하고, 고순도 및 저수율로 설정된 유동 분류 설정으로 유동 분류를 수행한다. 분류된 세포를 10%RPMI 배지에서 배양한다.
72시간 후, 95% 이상의 분류 효율을 보장하기 위해 GFP 양성 세포의 백분율에 대한 사후 분류 추정을 수행한다. 약물 내성을 매개하는 후성유전학적 요인을 확인하기 위한 드롭아웃 스크리닝. shRNA 라이브러리-형질도입된 세포를 10%RPMI에서 최대 5일 동안 배양한다.
복제된 1천만 개의 세포를 원심분리한다. 상층액을 버리고 펠렛을 영하 80도에 보관하십시오. 이들 샘플은 후성유전학적 shRNA 라이브러리에 대한 기준선 참조로서 기능할 것이다.
나머지 형질도입된 세포를 중복, R1 및 R2로서 배양하고, 각각 라이브러리의 500X 표현을 제공하는 세포 카운트로 유지한다. 중복 된 것 중 하나를 약물, 10 마이크로 몰 시타라빈으로 치료하고 다른 하나는 약물 치료없이 치료하십시오. 플라스크의 배지를 약물과 함께 또는 약물없이 72 시간마다 변경하십시오.
9 일의 누적 약물 노출에 대해 배지 변화를 세 번 반복하십시오. 약물 치료 9일째 후, 트리판 블루 배제 방법으로 세포의 생존율을 확인하였다. 나머지 생존 가능한 세포를 스핀다운하고, 멸균 PBS로 세척하고, 실온에서 5분 동안 280 g에서 원심분리한다.
상청액을 버리고 DNA 추출을 위해 펠렛을 영하 80으로 보관하십시오. PCR에 의한 통합된 shRNA의 증폭. 형질도입된 기준선 세포, 처리 및 처리되지 않은 세포로부터 DNA를 추출하고, 이어서 형광계를 사용하여 농도를 확인하고, 나타낸 바와 같이 필요한 DNA의 양을 계산하고, 샘플을 PCR의 첫 번째 라운드에 피검한다.
PCR 반응 혼합물은 열 사이클러 조건을 갖는 표 2에 묘사되어 있다. 튜브 당 850 나노 그램 DNA를 포함하는 여러 반응을 설정하여 총 43 개의 반응을 일으 킵니다. PCR 산물을 풀링하고 정제하십시오.
제품을 50 마이크로 리터 버퍼로 제거하고 정량화하고 마지막으로 마이너스 20으로 보관하십시오. 두 번째 라운드 PCR의 경우, 역방향 인덱스 프라이머를 사용하고 시약은 표 4에 표로 정리되어 있다. 음성 대조군과 함께 각 샘플에 대해 50 마이크로리터의 총 반응 부피에서 일차 PCR 산물 500 나노그램으로 네 개의 반응을 설정한다.
2%TBE 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 위해 전체 생성물을 로딩하고 하나의 KB 분자 사다리로 밴드 크기를 확인하십시오. 겔 문서화 시스템에서 PCR 산물을 시각화합니다. 특정 밴드를 절제하고 겔 정제 키트를 사용하여 정제하십시오.
키트를 사용한 정제에 대한 계산은 표 3에 제공된다. 용출 완충액의 30 마이크로리터의 최종 부피에서 각 용리액의 대략적인 농도를 마이크로리터 당 약 80 내지 90 나노그램으로 희석한다. 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석.
겔-정제된 생성물은 고갈된 shRNA 요구에 대한 판독 카운트를 얻기 위해 차세대 시퀀싱을 실시한다. 어댑터 시퀀스를 트리밍하고, 필터링된 읽기를 참조 시퀀스에 정렬하고, SAMtools를 사용하여 파일을 로드하여 정렬 요약을 가져옵니다. 트리밍된 fastQ 파일을 CRISPRCloud2에 로드하고 지침에 따라 분석을 수행합니다.
CRISPRCloud2에 제공된 링크를 클릭합니다. 화면 유형을 생존 및 드롭아웃 화면으로 선택합니다. 그룹 수를 설정하고 각 그룹의 이름을 입력합니다.
참조 라이브러리를 FASTA 파일 형식으로 업로드합니다. 업로드된 데이터가 처리되고 지정된 URL에서 결과를 사용할 수 있습니다. 대표 데이터.
이 그림은 MV4-11 시타라빈 농도 증가, 0.1 마이크로몰 내지 1, 000 마이크로몰로 처리된 MV4-11 모 및 내성 세포 및 MTT 분석에 의한 생존력 평가를 보여준다. 이 도면은 인간 EF-1 알파, 인간 CMV, 및 SFFV 프로모터에 대한 72시간의 말기에 유세포 분석기에 의해 정량화된 GFP의 대표적인 유동 플롯을 보여준다. 인간 CMV는 이질적인 피크를 보여주고, 인간 EF-1 알파와 SFFV는 단일 균질 피크를 나타낸다.
이 그림은 MV4-11에서 세 가지 다른 프로모터 효율에 대한 막대 그래프를 보여줍니다. SFFV 구동 GFP는 장기간의 배양에서 GFP의 침묵을 나타냈다. hEF-1 알파-구동 GFP 세포는 이들 세포의 분류 후 지속적인 발현을 나타냈다.
왼쪽 패널은 형광 현미경 하에서 48시간의 끝에서 293T로 형질감염된 풀링된 shRNA 라이브러리의 형질감염 효율을 보여준다. 오른쪽 패널은 다양한 바이러스 부피, 2, 4 및 8 마이크로리터를 갖는 293T 세포에서 풀 바이러스의 형질도입 효율을 보여준다. 이 수치는 30% 형질도입 효율을 달성하기 위해 1, 1.5, 2, 2.5 마이크로리터와 같이 다양한 부피의 바이러스를 갖는 MV4-11 내성 세포주에서 형질도입 효율을 나타낸다.
이 그림은 고순도 및 낮은 수율 분류 설정으로 30% 형질도입 효율을 갖는 GFP 양성 세포의 분류를 보여준다. 도면은 9일의 장기간의 시타라빈 노출에 대한 GFP 양성 분류된 세포에 대한 약물 처리의 개략적인 예시를 보여주고, 이어서 생존력을 확인하고 DNA에 대한 세포를 수집한다. 이 도면은 PCR의 첫 번째 및 두 번째 라운드에서 사용된 프라이머의 결합 영역을 보여준다.
이 도면은 NGS에 대해 겔 용출, 정제 및 주어진 첫 번째 라운드 PCR, 397 염기쌍, 및 두 번째 라운드 PCR 산물 399 염기쌍의 끝에서 PCR 산물의 밴드 크기를 예시한다. 이 도면은 AML에서 시타라빈 내성을 매개할 수 있는 후성유전학적 인자를 표적으로 하는 농축되거나 고갈된 shRNA의 표현을 예시한다. 결론. 이 프로토콜은 필수 유전자와 비필수 유전자를 체계적으로 조사하기 위한 표적 녹다운 스크리닝의 중요성을 강조하고, 이 접근법을 기능적 플랫폼으로 사용하여 약물 내성을 담당하는 표적을 식별할 수 있음을 보여줍니다.
