O objetivo geral do vídeo a seguir é demonstrar o uso da biblioteca epigenética shRNA agrupada para realizar uma triagem de seleção negativa. Esta triagem permite identificar alvos epigenéticos específicos através do sequenciamento. Este procedimento poderia ajudar a identificar os fatores epigenéticos responsáveis pela mediação da resistência à cytarabina adquirida na LMA As etapas são as seguintes.
Seleção do promotor mais potente para obter expressão persistente e prolongada dos shRNAs. O protocolo atual se concentra na triagem RNAi usando a biblioteca de fator epigenético shRNA na linha celular MV4-11 resistente à cytarabina. Os promotores utilizados para este fim são o EF-1 alfa humano, o CMV humano e o SFFV, promotores que expressam proteína de fluorescência verde.
Pegue a contagem de células usando o método de exclusão azul trypan. Suspenda as células em meio 10%RPMI contendo 8 microgramas por mL de polibrene. Semente 1 milhão de células em 1,5 ml de médio por poço de uma placa de seis poços em triplicados.
Adicione diferentes volumes de lentivírus concentrados. Por exemplo, lentivírus, por exemplo, 10, 20 e 40 microliteres, dependendo do título dos lentivírus para cada poço. Gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.
Realize a spinfeção por centrifugação a 920 g a 37 graus centígrados por 90 minutos. Incubar imediatamente as placas em uma incubadora de dióxido de carbono. Observe o GFP ao final de 48 horas e quantifique o mesmo ao final de 72 horas.
Em seguida, siga os passos descritos no fluxograma para escolher o promotor mostrando uma expressão GFP consistente em toda a cultura. Preparação da biblioteca de fator epigenético humano lentiviral agrupado. Cultura 293T células em um número de passagem baixa com uma boa taxa de proliferação em três pratos de cultura celular de 10 centímetros com 8ml de 10% de meio DMFM em cada placa.
Uma vez que as células atinjam 60% de confluência, substitua-se completamente por meio fresco. Prepare a mistura de transfecção conforme delineado que contém meio livre de soro, embalagem lentiviral plasmid PAX2, envelope plasmid pMD2. G, plasmídeos de biblioteca agrupados, e finalmente o reagente de transfecção.
Bata na mistura para misturar bem e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione a mistura de transfecção às células 293T e misture suavemente girando as placas. Incubar as placas em uma incubadora de dióxido de carbono.
Troque o meio após 24 horas. Após 48 horas, verifique se há expressão GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir alta eficiência de transfecção em células 293T. Colete os supernantes do vírus após 48, 60 e 72 horas e armazene-os a 4 graus, e adicione meio fresco, 8ml, em cada ponto após a coleta do vírus.
Filtre os vírus agrupados com filtro de 0,4 mícnico. Para obter um alto título de vírus, concentre os vírus agrupados por ultracentrifugação. Transfira os supernantes do vírus filtrado para 70 tubos Ti, e centrífuga a 18.000 g durante 2 horas.
Use rotor pré-cozido e centrífuga a 4 graus. Retire os tubos da centrífuga cuidadosamente e remova o sobrenatante completamente. Resuspenque a pelota suavemente em 400 microliter de DMEM sem FBS e antibióticos usando uma micropipette, incubar no gelo por 1 hora.
Alíquotar os vírus e congelar a menos 80 graus. Calcule a concentração do vírus como mostrado. Estimativa da eficiência de transdução de lentivírus.
Transdutor células 293T com vírus concentrado em diferentes volumes, 2, 4 e 8, para confirmar a preparação bem sucedida do lentivírus. Valor para o vírus concentrado para 100X para realizar um experimento de titulação na linha celular alvo. Semente 1 milhão de linha celular alvo em 1,5 ml de meio 10% RPMI contendo 8 microgramas por ml de polibrene em um poço de uma placa de seis poços.
Adicione quatro volumes diferentes, 1, 1,5, 2, 2,5 microliter de vírus 100X. Realize a spinfection por centrifugação da placa a 920 g por 90 minutos a 37 graus centígrados. Após 72 horas, meça a porcentagem de células positivas de GFP por citometria de fluxo.
Determine o volume dos vírus para obter 30% de eficiência de transdução. Esta baixa eficiência de transdução é para garantir uma integração única de shRNA por célula. Transdução da biblioteca de shRNA epigenética agrupada na linha celular resistente a medicamentos.
Calcule o número de células a serem tomadas para o experimento conforme abaixo com base no número de integradores virais. Resuspend 11 milhões de células em 16 ML de 10% RPMI médio. Adicione polibreno, oito microgramas por ml e misture bem, e depois adicione o volume necessário de vírus para obter 30% de eficiência de transdução como calculado anteriormente.
Semente todas as células em uma placa de seis poços a uma densidade de 1 milhão de células por 1,5 ml por poço. Centrifugar a placa por 90 minutos a 920 g a 37 graus centígrados. Incubar a placa durante a noite em uma incubadora de dióxido de carbono.
Após 24 horas, troque o meio e transfira as células transduzidas para um frasco T-75. Após 48 horas, verifique o GFP sob um microscópio de fluorescência para garantir uma transdução bem sucedida. Após 72 horas, quantita o GFP por citometria de fluxo.
Enriquecimento das células positivas do GFP. Expanda as células transduzidas, culminando-as a uma densidade de 0,5 milhões por ml por 5 a 7 dias, e realize a triagem de fluxo com o ajuste de fluxo definido como alta pureza e baixo rendimento. Cultume as células classificadas em um meio de 10%RPMI.
Após 72 horas, realize a estimativa pós-classificação do percentual das células positivas do GFP para garantir mais de 95% de eficiência de classificação. Rastreamento de abandono para identificar fatores epigenéticos que mediam a resistência às drogas. Cultura as células transduzidas pela biblioteca shRNA em 10% RPMI por até 5 dias.
Centrifugar 10 milhões de células em duplicatas. Descarte o supernatante e armazene as pelotas a menos 80 graus. Essas amostras servirão como referência de base para a biblioteca epigenética shRNA.
Cultura as células transduzidas restantes como duplicatas, R1 e R2, cada uma mantida em uma contagem de células que fornece uma representação de 500X da biblioteca. Trate uma das duplicatas com a droga, 10 cytarabina micromolar, e a outra sem o tratamento medicamentoso. Troque o meio para os frascos com, e sem a droga, a cada 72 horas.
Repita a variação média três vezes para uma exposição cumulativa de drogas de 9 dias. Após o 9º dia de tratamento medicamentoso, verifique a viabilidade das células pelo método de exclusão azul trypan. Gire as células viáveis restantes, lave com PBS estéril e centrífuga a 280 g por 5 minutos à temperatura ambiente.
Descarte o supernatante e armazene as pelotas a menos 80 para extração de DNA. Amplificação dos shRNAs integrados por PCR. Extrair DNA das células de base transduzidas, células tratadas e não tratadas, seguidas pela verificação da concentração usando fluorômetro, calcular a quantidade de DNA necessária como mostrado e submeter as amostras à primeira rodada de PCR.
A mistura de reação PCR é retratada na tabela 2 com as condições do cicloviário térmico. Configure múltiplas reações contendo 850 DNA de nanograma por tubo para um total de 43 reações. Acumule os produtos PCR e purifique-os.
Elute os produtos em 50 tampão de microliter e quantificá-los, e finalmente, armazenar a menos 20. Para pcr segunda rodada, use primers de índice reverso e os reagentes são tabulados na tabela 4. Configure quatro reações com 500 nanogramas do produto PCR primário em um volume total de reação de 50 microliter para cada amostra, juntamente com o controle negativo.
Carregue todo o produto para eletroforese usando gel de agarose 2%TBE e confirme o tamanho da banda com uma escada de molécula KB. Visualize os produtos PCR no sistema de documentação do gel. Extirpa a banda específica e purificar usando um kit de purificação de gel.
Os cálculos para a purificação com o kit estão fornecidos na tabela 3. Elute em um volume final de 30 microliter de tampão de eluição com a concentração aproximada de cada eluente em torno de 80 a 90 nanogramas por microliter. Sequenciamento de próxima geração e análise de dados.
Os produtos purificados em gel são submetidos ao sequenciamento de próxima geração para obter contagem de leitura para as necessidades de shRNA empobrecidos. Corte as sequências do adaptador, alinhe as leituras filtradas às sequências de referência, carregue os arquivos usando SAMtools para obter o resumo de alinhamento. Carregue os arquivos fastQ aparados no CRISPRCloud2 e execute a análise de acordo com as instruções.
Clique no link fornecido para o CRISPRCloud2. Selecione o tipo de tela como telas de sobrevivência e abandono. Defina o número de grupos e digite o nome de cada grupo.
Carregue a biblioteca de referências como o formato de arquivo FASTA. Os dados carregados são processados e os resultados estão disponíveis na URL dada. Dados representativos.
Este número mostra células parentais e resistentes MV4-11 tratadas com aumento da concentração de cytarabina, 0,1 micromolar para 1.000 micromolar e avaliação de viabilidade pelo ensaio MTT. Esta figura mostra parcelas representativas de fluxo do GFP quantificadas por citometria de fluxo no final de 72 horas para os promotores humanos EF-1 alfa, CMV humano e SFFV. O CMV humano mostra nosso pico heterogêneo, enquanto os humanos EF-1 alfa e SFFV mostram um único pico homogêneo.
Este número mostra o gráfico da barra para as três diferentes eficiências de promotores em MV4-11. O GFP orientado pelo SFFV mostrou silenciamento do GFP na cultura prolongada. hEF-1 células GFP orientadas alfa mostraram expressão sustentada pós classificação dessas células.
O painel esquerdo mostra a eficiência de transfecção da biblioteca de shRNA agrupada transfeccionada em 293T no final de 48 horas sob microscopia de fluorescência. O painel direito mostra a eficiência de transdução do vírus da piscina em células 293T com volumes de vírus variados, 2, 4 e 8 microliter. Este número representa a eficiência de transdução na linha celular resistente MV4-11 com volumes variados de vírus, como 1, 1,5, 2, 2,5 microliter para alcançar 30% de eficiência de transdução.
Este número mostra a classificação das células positivas GFP com eficiência de transdução de 30% com alta pureza e ajuste de classificação de baixo rendimento. A figura mostra a ilustração esquemática do tratamento medicamentoso para as células classificadas positivas do GFP para uma exposição prolongada de cytarabina de 9 dias, seguida pela verificação da viabilidade e coleta das células para DNA. Este número mostra as regiões vinculantes do primer usado na primeira e segunda rodada de PCR.
Esta figura ilustra o tamanho da banda do produto PCR no final da primeira rodada pcr, par base 397, e o segundo par de base pcr 399 rodada, que foi elucido, purificado e dado para NGS. Esta figura ilustra a representação dos shRNAs enriquecidos ou esgotados visando os fatores epigenéticos que poderiam mediar a resistência à cytarabina na LMA. Conclusão. Este protocolo destaca a importância da triagem de knockdown direcionada para interrogar genes essenciais e não essenciais sistematicamente e demonstra o uso dessa abordagem como plataforma funcional, permitindo a identificação de alvos responsáveis pela resistência a medicamentos.
