Общей целью следующего видео является демонстрация использования объединенной эпигенетической библиотеки шРНК для проведения скрининга отрицательного отбора. Этот скрининг позволяет идентифицировать конкретные эпигенетические мишени путем секвенирования. Эта процедура может помочь определить эпигенетические факторы, ответственные за опосредование приобретенной резистентности к цитарабину при ОМЛ.
Подбор наиболее мощного промотора для получения стойкой и длительной экспрессии шРНК. Текущий протокол фокусируется на скрининге РНКи с использованием библиотеки шРНК эпигенетического фактора в цитарабин-резистентной клеточной линии MV4-11. Промотерами, используемыми для этой цели, являются человеческий EF-1 альфа, человеческий ЦМВ и SFFV, промоторы, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок.
Возьмите количество ячеек с помощью метода исключения trypan blue. Суспендировать клетки в 10%-ной rpmI среде, содержащей 8 мкг на мл полибрена. Посейте 1 миллион клеток в 1,5 мл среды на лунку шестилуночной пластины в трех экземплярах.
Добавляйте различные объемы концентрированных лентивирусов. Например, лентивирусы, например, 10, 20 и 40 микролитров, в зависимости от титра лентивирусов к каждой лунке. Аккуратно покрутите тарелку, чтобы перемешать содержимое.
Выполняют спинфекцию центрифугированием при 920 г при 37 градусах по Цельсию в течение 90 минут. Немедленно высиживайте пластины в углекислом инкубаторе. Соблюдайте GFP в конце 48 часов и количественно оценивайте его в конце 72 часов.
Затем выполните действия, описанные на блок-схеме, чтобы выбрать промоутера, показывающего согласованное выражение GFP во всем языке и региональных параметрах. Подготовка объединенной лентивирусной библиотеки шРНК эпигенетического фактора человека. Культивируйте клетки 293T с низким проходным числом с хорошей скоростью пролиферации в трех 10-сантиметровых чашках для культивирования клеток с 8 мл 10% среды DMFM в каждой тарелке.
Как только клетки достигнут 60%-ной конфлюзии, полностью замените их свежей средой. Приготовьте трансфекционную смесь, как описано, которая содержит бессывороточную среду, лентивирусную упаковочную плазмиду PAX2, плазмиду оболочки pMD2. G, объединенная библиотека плазмид и, наконец, трансфекционный реагент.
Смажьте смесь, чтобы она хорошо перемешалась и инкубировалась при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте трансфекционную смесь в ячейки 293T и аккуратно перемешайте, закручивая пластины. Инкубируйте пластины в инкубаторе углекислого газа.
Измените среду через 24 часа. Через 48 часов проверьте экспрессию GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить высокую эффективность трансфекции в клетки 293T. Соберите супернатанты вируса через 48, 60 и 72 часа и храните их при 4 степени, и добавляйте свежую среду, 8 мл, в каждый момент времени после сбора вируса.
Фильтруйте объединенные вирусы с помощью 0,4-микронного фильтра. Для получения высокого титра вирусов концентрируют объединенные вирусы методом ультрацентрифугирования. Переложите отфильтрованные вирусные супернатанты в пробирки 70 Ti и центрифугу по 18 000 г в течение 2 часов.
Используйте предварительно охлажденный ротор и центрифугу при 4 градусах. Осторожно выньте трубки из центрифуги и удалите супернатант полностью. Повторно суспендировать гранулу аккуратно в 400 микролитрах DMEM без FBS и антибиотиков с помощью микропипетки, инкубировать на льду в течение 1 часа.
Аликвотирует вирусы и замерзает при минус 80 градусах. Рассчитайте концентрацию вируса, как показано на рисунке. Оценка эффективности трансдукции лентивирусов.
Трансдуцировать клетки 293T с концентрированным вирусом в разных объемах, 2, 4 и 8, чтобы подтвердить успешную подготовку лентивируса. Значение для концентрированного вируса до 100X для выполнения эксперимента по титрованию в целевой клеточной линии. Посеять 1 млн линий целевых клеток в 1,5 мл 10%RPMI среды, содержащей 8 мкг на мл полибрена, в одной лунке шестилуночной пластины.
Добавьте четыре разных тома, 1, 1,5, 2, 2,5 микролитра 100X вирусов. Выполняют спинфекцию путем центрифугирования пластины при 920 г в течение 90 минут при 37 градусах по Цельсию. Через 72 часа измерьте процент положительных клеток GFP с помощью проточной цитометрии.
Определите объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции. Эта низкая эффективность трансдукции обеспечивает интеграцию одной шРНК на клетку. Трансдукция объединенной эпигенетической библиотеки шРНК в лекарственно-устойчивую клеточную линию.
Рассчитайте количество клеток, которые будут взяты для эксперимента, как показано ниже, исходя из количества вирусных интегрантов. Повторное суспендирование 11 миллионов клеток в 16 мл 10%RPMI среды. Добавьте полибрен, восемь микрограмм на мл и хорошо перемешайте, а затем добавьте необходимый объем вирусов для получения 30% эффективности трансдукции, как было рассчитано ранее.
Посейте все клетки на шестилуночной пластине при плотности 1 миллион клеток на 1,5 мл на лунку. Центрифугируйте пластину в течение 90 минут при 920 г при 37 градусах по Цельсию. Инкубируйте пластину на ночь в инкубаторе углекислого газа.
Через 24 часа измените среду и перенесите трансдуцированные клетки в колбу Т-75. Через 48 часов проверьте GFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы обеспечить успешную трансдукцию. Через 72 часа количественно оцените GFP с помощью проточной цитометрии.
Обогащение GFP-положительных клеток. Расширьте трансдуцированные клетки, культивируя их при плотности 0,5 млн на мл в течение 5-7 дней, и выполните проточную сортировку с настройкой сортировки потока, установленной как высокая чистота и низкий выход. Культивируйте отсортированные клетки в среде 10% RPMI.
Через 72 часа выполните оценку после сортировки процента положительных ячеек GFP, чтобы обеспечить эффективность сортировки более 95%. Скрининг отсева для выявления эпигенетических факторов, опосредующих лекарственную устойчивость. Культивируйте клетки, трансдуцированные библиотекой шРНК, в 10% RPMI в течение 5 дней.
Центрифуга 10 миллионов клеток в дубликатах. Выбросьте супернатант и храните гранулы при минус 80 градусах. Эти образцы будут служить базовым ориентиром для эпигенетической библиотеки шРНК.
Культивируйте оставшиеся трансдуцированные клетки как дубликаты, R1 и R2, каждая из которых поддерживается при количестве клеток, которое обеспечивает представление библиотеки в 500 раз. Обработайте один из дубликатов препаратом, 10 микромоляльным цитарабином, а другой без медикаментозного лечения. Меняйте среду для колб с препаратом и без него каждые 72 часа.
Повторите изменение среды три раза для кумулятивного воздействия препарата в течение 9 дней. После 9-го дня медикаментозного лечения проверьте жизнеспособность клеток методом исключения трипан-синего цвета. Открутите оставшиеся жизнеспособные клетки, промыть стерильным PBS и центрифугировать по 280 г в течение 5 минут при комнатной температуре.
Выбросьте супернатант и храните гранулы при минус 80 для извлечения ДНК. Амплификация интегрированных шРНК методом ПЦР. Извлеките ДНК из трансдуцированных базовых клеток, обработанных и необработанных клеток, с последующей проверкой концентрации с помощью флуорометра, рассчитайте необходимое количество ДНК, как показано на рисунке, и подвергните образцы первому раунду ПЦР.
Реакционная смесь ПЦР изображена в таблице 2 с условиями термоциклера. Настройте несколько реакций, содержащих 850 нанограммОВ ДНК на трубку, в общей сложности 43 реакции. Объедините продукты ПЦР и очистите их.
Элюируйте продукты в буфере 50 микролитров и количественно оценивайте их, и, наконец, храните при минус 20. Для второго раунда ПЦР используют праймеры с обратным индексом, а реагенты сведены в таблицу 4. Настройте четыре реакции с 500 нанограммами первичного продукта ПЦР в общем объеме реакции 50 микролитров для каждого образца вместе с отрицательным контролем.
Загрузите весь продукт для электрофореза с использованием 2%TBE агарозного геля и подтвердите размер полосы с помощью одной лестницы молекул KB. Визуализируйте продукты ПЦР в системе документации на гель. Иссейте определенную полосу и очистите с помощью набора для очистки геля.
Расчеты по очистке с помощью комплекта приведены в таблице 3. Элютируют в конечном объеме 30 микролитров буфера элюирования с приблизительной концентрацией каждого элюента около 80-90 нанограмм на микролитр. Секвенирование и анализ данных нового поколения.
Продукты, очищенные гелем, подвергаются секвенированию следующего поколения для получения показаний для истощенных потребностей в шРНК. Обрежьте последовательности адаптеров, выровняйте отфильтрованные чтения по эталонным последовательностям, загрузите файлы с помощью SAMtools для получения сводки выравнивания. Загрузите обрезанные файлы fastQ в CRISPRCloud2 и выполните анализ в соответствии с инструкциями.
Нажмите на ссылку, предоставленную для CRISPRCloud2. Выберите тип экрана Как Экран Выживание и Выпадение. Задайте количество групп и введите имя каждой группы.
Загрузите справочную библиотеку в формате файла FASTA. Загруженные данные обрабатываются, и результаты доступны по указанному URL-адресу. Репрезентативные данные.
На этом рисунке показаны родительские и резистентные клетки MV4-11, обработанные повышенной концентрацией цитарабина, от 0,1 микромоляра до 1000 микромоляров и оценкой жизнеспособности с помощью анализа MTT. На этом рисунке показаны репрезентативные графики потока GFP, количественно оцененные проточной цитометрией в конце 72 часов для человеческих EF-1 альфа, человеческих ЦМВ и промоторов SFFV. Человеческий ЦМВ показывает наш гетерогенный пик, в то время как человеческий EF-1 альфа и SFFV показывают один однородный пик.
На этом рисунке показана гистограмма для трех различных показателей эффективности промоутера в MV4-11. GFP, управляемый SFFV, показал глушение GFP в длительной культуре. HEF-1 альфа-управляемые клетки GFP показали устойчивую экспрессию после сортировки этих клеток.
Левая панель показывает эффективность трансфекции объединенной библиотеки шРНК, трансфектированной в 293T в конце 48 часов под флуоресцентной микроскопией. Правая панель показывает эффективность трансдукции вируса пула в клетках 293T с различными объемами вируса, 2, 4 и 8 микролитров. Этот показатель представляет эффективность трансдукции в резистентной клеточной линии MV4-11 с различными объемами вирусов, таких как 1, 1,5, 2, 2,5 микролитра для достижения 30% эффективности трансдукции.
На этом рисунке показана сортировка положительных ячеек GFP с эффективностью трансдукции 30% с высокой чистотой и низкой урожайностью. На рисунке показана схематическая иллюстрация медикаментозного лечения GFP-положительными отсортированными клетками при длительном воздействии цитарабина в течение 9 дней с последующей проверкой жизнеспособности и сбором клеток для ДНК. На этом рисунке показаны области связывания праймера, используемого в первом и втором раунде ПЦР.
Этот рисунок иллюстрирует размер полосы продукта ПЦР в конце первого раунда ПЦР, 397 пары оснований и второго раунда ПЦР-продукта 399 пары оснований, который был элюирован гелем, очищен и дан для NGS. Этот рисунок иллюстрирует представление обогащенных или истощенных шРНК, нацеленных на эпигенетические факторы, которые могут опосредуть резистентность к цитарабину при ОМЛ. Заключение. Этот протокол подчеркивает важность целенаправленного нокдаун-скрининга для систематического опроса как существенных, так и несущественных генов и демонстрирует использование этого подхода в качестве функциональной платформы, позволяющей идентифицировать мишени, ответственные за лекарственную устойчивость.
