פרוטוקול זה מאפשר להבטיח בידוד טוב של דם חוץ תאי והודעה על מספר גבוה יותר של חלבוני EBDF. בהשוואה לטכניקות בידוד אחרות, זה אחד טוען כי זה יותר יושרה ופעילויות אנכיות. כלי רכב חשמליים נחקרים יותר ויותר LC, כמו גם תנאים פתולוגיים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכות שאנו בוחרים לאפיין וללמוד את כלי רכב חשמליים. עבור תוכן זה או האתיקה הביולוגית נדרשת תשומת לב מיוחדת בעת איטרטינג כלי רכב חשמליים, כמו בתוצאות התרבות בניסויים הבאים. הדגמה חזותית היא קריטית כדי לארח ציוד ספציפי כגון עמוד כרומטוגרפיה הדרה בגודל תוצרת בית, כמו גם את המעורבות של מונה חלקיקים ספקטרומטר מסה.
עוזר להדגים את ההליך יהיה אנטונלה רפו-רומרו, מהמעבדה. התחל על-ידי בידוד מראש של צלבים חוץ-תאיים, או כלי רכב חשמליים, מהמצב הבינוני. להעביר את המצב בינוני תרבות מ microglia או תרבויות מקרופאג לתוך צינור חרוט צנטריפוגה זה ב 1, 200 פעמים G במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים.
מעבירים את העל-טבעי לצינור חרוטי חדש וצנטריפוגה למשך 20 דקות נוספות כדי לחסל גופים אפופטיים. ואז להעביר את supernatant לתוך צינור פוליקרבונט 10.4 מיליליטר. מניחים את הצינור לתוך רוטור TI 70.1 וצנטריפוגה אולטרה ב 100, 000 פעמים G במשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את כלי רכב חשמליים.
לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולתלות את גלולה ב 200 microliters של 0.2 מיקרומטר מסונן PBS. כדי לבודד את כלי רכב חשמליים, הכן עמוד כרומטוגרפיה של אי-הכללה בגודל תוצרת בית על-ידי כביסה ועיקור של עמוד כרומטוגרפיה מזכוכית והצבת מסנן 60 מיקרוליטר בתחתית. ערמו את העמוד עם מטריצת בסיס סינון ג'ל אגרוז מקושרת כדי ליצור שלב נייח בקוטר 0.6 ס"מ וגובה של 20 ס"מ.
לאחר מכן לשטוף את השלב עם 50 מיליליטר של 0.2 מיקרו מטר מסונן PBS. במידת הצורך, יש לאחסן את העמודה בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. מניחים את גלולת EV resuspended על גבי השלב נייח ולאסוף 20 שברים רציפים של 250 microliters תוך המשך הוספת PBS לחלק העליון של השלב נייח.
ניתן לאחסן את השברים במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע ניתוח מעקב חלקיקים, לעשות דילול של כל שבר עם 0.2 מיקרומטר מסונן PBS ומערבולת זה כדי לחסל אגרגטים. שים את הפתרון במזרק מיליליטר אחד והצב אותו במשאבת המזרק האוטומטית.
לאחר מכן, התאימו את הגדרות המצלמה לרמת ההתרמה המתאימה של המסך ורמת המצלמה ולחצו על 'הפעל'. לטעון את המדגם בתא הניתוח עם קצב עירוי של 1000 במשך 15 שניות. לאחר מכן להקטין ולייצב את זרימת המהירות עבור הקלטת וידאו לקצב עירוי של 25 במשך 15 שניות.
צלם שלושה סרטונים רצופים של 60 שניות של זרימת החלקיק. לאחר מכן התאימו את רמת המצלמה ואת סף הזיהוי לפני ניתוח וידאו. לחץ על הגדרות אישור כדי להתחיל את הניתוח, ולחץ על ייצוא כאשר נעשה.
לשטוף את המערכת עם מיליליטר אחד של 0.2 מיקרומטר מסונן PBS בין כל שבר. אם אתם מבצעים ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים, השתמשו במסנן צנטריפוגלי של 50 קילודלטון כדי לרכז את שברי הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל. להפקת חלבון, יש לערבב 50 מיקרוליטרים של חיץ RIPA עם דגימת EV למשך חמש דקות על הקרח.
Sonicate הדגימות שלוש פעמים ב 500 וואט ו 20 קילוהרץ במשך חמש שניות. לאחר מכן להסיר פסולת כלי רכב על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר בידוד החלבונים, בצעו נדידת חלבונים בג'ל הערימה של ג'ל פוליאקרילי 12%.
מערבבים את החלבונים בג'ל עם כחול קומאסי במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ואז excise כל חתיכת ג'ל צבעוני לחתוך אותו לחתיכות קטנות. שים את חתיכות הג'ל דרך סדרה של שטיפות רצופות כמתואר בכתב היד.
ואז לייבש אותם לחלוטין עם ריכוז ואקום. לאחר ייבוש לבצע הפחתת חלבון עם 100 microliters של 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט המכיל 10 מילימולרי Dithiothreitol במשך שעה אחת ב 56 מעלות צלזיוס. הבא לבצע אלקילציה חלבון עם 100 microliters של 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט המכיל 50 מילימולאר iodoacetamide במשך 45 דקות בחושך.
לשטוף את חתיכות הג'ל על פי הוראות כתב היד ולייבש אותם לחלוטין על רכז ואקום. בצע עיכול חלבון עם 50 microliters של טריפסין ב 20 מילימולר אמוניום ביקרבונט ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לחלץ את החלבונים מתעכלים מן הג'ל עם 50 microliters של 100% ACN במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 15 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מתמשך.
לאחר מכן לחלץ את החלבונים פעמיים עם 50 microliters של 5%TFA ב 20 מילימולר אמוניום ביקרבונט, תוך ערבוב ברציפות במשך 20 דקות. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ACN וממשיכים לבחוש במשך 10 דקות. לאחר מכן, ייבשו את החלבונים והשקיעו אותם מחדש ב-20 מיקרוליטרים של 0.1%TFA.
התפל את הדגימה באמצעות קצה פיפט 10 מיקרוליטר עם C 18 מדיה פאזה הפוכה עבור התפלה והתרכזות פפטידים. לאחר מכן ליטף אותם עם ACN ו 0.1% חומצה פורמית. ייבשו לחלוטין את הדגימה עם רכז ואקום והשקיעו אותה מחדש ב-20 מיקרוליטרים של ACN ו-0.1% חומצה פורמית לספקטרומטריית מסת טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית, או LC-MS.
לטעון את הפפטידים מתעכל לתוך המכשיר ולבצע ניתוח מדגם. כדי לאשר בידוד EV, כל שבר SCC היה נתון לניתוח מעקב חלקיקים. מספר החלקיקים היה גבוה משמעותית בשברים 5, 6 ו-7.
שברים אלה היו מאגר לתוך מדגם אחד 2F-EV חיובי, ובהשוואה עם שברים שליליים EV, 1F-EV שלילי ו 3F-EV שלילי, באמצעות ניתוח כתם מערבי. התוצאות הראו נוכחות של חלבון הלם חום 90 בדגימה חיובית EV ובבקרת ליזאט התא. מיקרוסקופ אלקטרונים של המדגם החיובי EV הראה כלי רכב חשמליים בטווח גודל סביב 100 ננומטר ו 400 ננומטר.
ניתוח פרוטאומיקה בוצע על מנת לזהות חלבונים מזהמים בדגימות שליליות EV ולאפיין את תכולת החלבון של כלי רכב חשמליים. החלבונים שזוהו הושוו בין 1F-EV שלילי מדגימות חיוביות 2F-EV, כמו גם בין 2F-EV חיובי מדגמים שליליים 3F-EV. בשיטה לא ממוקדת זו, מאגר של 536 חלבונים הוגשו למסד הנתונים ExoCarta והובילו לזיהוי של 86 חלבונים הקשורים ל- EV.
בנוסף, בריכה זו אפשרה גם זיהוי של אינטראקציות חלבון ואת הפונקציות הביולוגיות הקשורות שלהם. נמצא כי החלבונים מהדגימה החיובית EV שיחקו תפקידים במסלולים חיסוניים ונוירו-פרוטקטיביים. ההשפעות של כלי רכב חשמליים שמקורם במיקרוגליה הוערכו על נויריט נויריט עם תאי PC 12 ותאי עצב ראשוניים של חולדות.
עלייה משמעותית בהגדלה נצפתה תחת כלי רכב חשמליים בהשוואה לשליטה. כלי רכב חשמליים שמקורם במאקרופאג' הוערכו על פלישת תאי גליומה. נמצא כי כלי רכב חשמליים פגעו בצמיחה ובפלישה של כדוריות גליומה.
הדבר החשוב ביותר לזכור הוא באמת בזהירות להשליך את supernatant של צעד אולטרהצנטריפוגה על מנת למנוע אובדן של כלי רכב חשמליים בהליך זה. אנו מעדיפים גישה בקנה מידה גדול ולא ממוקד להתמקד בתכולת החלבון כולה ולאחר מכן את ההשפעה האנכית של כלי רכב חשמליים. אז התוכן בחומצות גרעין יכול להיות קשור באמצעות ניתוח.
עם גישה זו מתרבות ראשונית, אנו מסוגלים להפלות בין חלבוני EV וחלבונים חינם כי הם מחוץ למגוון. אז נשאלת השאלה אם קרישה זו היא חפץ או ליתר דיוק כמה אמיתי אחר
