כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל היא גישה שימושית להפרדת תת-המזון של שלפוחיות חיידקיות בגודל הטרוגני ולהסרת חומצות גרעין וחלבונים מתרופות-על חיידקיות. כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל זולה יותר, מהירה יותר ווניתנת לשחזור יותר מאשר טכניקות הפרדה אחרות, כולל אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות. הדגמנו את הפוטנציאל של גישה זו באמצעות שלפוחיות A.actinomycetemcomitans, אבל אנחנו מצפים שזה יכול להיות מיושם על אוכלוסיות ארסיות חיידקיות אחרות בגודל הטרוגני גם כן.
הקפידו לנפח כראוי את כל פתרונות החיץ והחרוזים ולהכניס את הפתרון לאט מבלי להכניס בועות, אך מהר מספיק החרוזים אורזים בצורה הומוגנית מבלי להתייבש. כדי להתחיל, השתמש מוט זכוכית לערבב בקבוק מלאי של מדיום סינון ג'ל ויוצקים את הנפח הנדרש כדי למלא את העמודה בתוספת כ 50% עודף לתוך בקבוק זכוכית. אפשר החרוזים להתיישב ולפרק את הנוזל העודף.
יש להחזיר את החרוזים במאגר אלוטיון לפתרון סופי של כ-70% ג'ל ו-30% חיץ ולדגה את הפתרון תחת ואקום. הר את העמודה על מעמד טבעת במיקום האנכי ומלא את העמודה במאגר אלוטיון כדי להרטיב את הקירות לפני ניקוז המאגר עד שיישאר רק סנטימטר אחד. לאחר מכן, בזהירות pipette חרוזי הג'ל לתוך העמודה תוך ניקוז בו זמנית את המאגר עודף כדי למנוע החרוזים להתיישב עד העמוד ארוז לגובה של כשני סנטימטרים מתחת לתחתית מאגר העמוד.
לפני טעינת המדגם, degas חיץ elution תחת ואקום. לשטוף את העמודה עם כ - כפול את נפח העמודה של מאגר elution. ברגע שהמאגר מגיע לחלק העליון של שכבת הג'ל, הוסף בזהירות שני מיליליטר של 100 עד 200 ננומולר לליטר דגימת רסיס ממברנה החיצונית על גבי שכבת הג'ל מבלי להפריע לפני השטח ולתת לדגימה להיכנס לג'ל.
לאט לאט מוסיפים את מאגר ההתחמקות לעמוד מבלי להפריע לשכבת הג'ל ומניחים צינור 50 מיליליטר מתחת לעמוד. כדי למנוע ייבוש של העמודה, הוסף בו-זמנית מאגר אלוטציה לראש העמודה. לאחר איסוף 20 מיליליטר של eluate, למקם מתלה של צינורות 1.5 מיליליטר מתחת לעמוד.
לאסוף סך של 96 שברים מיליליטר אחד בכל צינור. בעת איסוף הדגימות, הוסף ברציפות מאגר אלוטיון לעמודה. כדי לנקות את העמודה, הפעל נפח עמודה אחת של נתרן הידרוקסיד טוחנת 0.1 דרך העמודה ואחריו שני כרכים עמודה של מאגר elution.
כדי למדוד את ריכוזי השומנים, pipette 50 microliters של כל שבר לתוך צלחת 96 היטב. מוסיפים 2.5 מיקרוליטרים של צבע ליפופילי לכל באר. לאחר 15 שניות, למדוד את עוצמת פלורסנס.
כדי למדוד את הריכוז של חלבון של עניין, להוסיף 100 microliters של כל שבר לתוך בארות בודדות של צלחת אימונו ELISA. לאחר שלוש שעות ב 25 מעלות צלזיוס, decant את תכולת הצלחת. לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם 200 microliters של מאגר לשטוף ELISA לכל לשטוף decanting את הצלחת לאחר כל לשטוף.
הוסף 200 מיקרוליטרים של חציית חוצץ לכל באר עבור דגירה של שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, decant את הצלחת ולהוסיף 100 microliters של נוגדן ראשוני בחסימת חוצץ עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, decant את הצלחת לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ לשטוף ELISA כפי שהוכח.
לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 100 microliters של נוגדן משני במאגר לשטוף ELISA לכל באר במשך שעה אחת דגירה ב 25 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת כפי שהודגם ולהוסיף 100 microliters של פתרון TMB לכל באר עבור דגירה של 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. כאשר מתפתח צבע כחול, הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר ומדוד את הספיגה ב 450 ננומטר.
לאחר טיהור עמודת אי-הכללה בגודל של תרבות A.actinomycetemcomitans supernatant כפי שהודגם, נצפו שתי פסגות שומנים נפרדות, המתאימות לשלל הממברנה החיצונית הגדולה והקטנה המיוצרת על ידי זן זה. ניתוח ELISA של שברי המדגם גילה כי הרעלן קשור בעיקר עם תת-אוכלוסייה של שלל קרום החיצוני גדול. ניתוח כתמי אימונו נתן תוצאות דומות אך רועשות יותר, מה שמצביע על כך שגישה זו פחות רגישה מ- ELISA.
כפי שנצפו, טכניקה כרומטוגרפיה זו מסוגלת להסיר כמויות משמעותיות של חלבונים חינם מן ההכנות של שלל הממברנה החיצונית. עם זאת, חשוב לציין כי ריכוז החלבון הכולל אינו בהכרח בקורלציה עם ריכוז חלבונים ספציפיים. חשוב להיות זהירים מאוד במהלך האריזה והריצה של העמודה כדי למנוע בועות ולמנוע את התייבשות העמודה.
פיזור אור דינמי, מעקב אחר חלקיקים וביקרוסקופיה יכולים להתבצע בעקבות כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל כדי לקבוע את הגודל ומאפיינים אחרים של שלטי הממברנה החיצונית המופרדים.
