פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת פולימראז זרימה רציפה המבוססת על השבב המיקרופלואידי, וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג דרך פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה. תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה מסורתית המשמשת להגברה של גן המטרה.
עם זאת, PCR מסורתי גוזל זמן רב בגלל יעילות השונות בטמפרטורה נמוכה. עבודה זו מציעה מערכת PCR זרימה רציפה המבוססת על שבב microfluidic. ניתן לקצר מאוד את זמן ההגברה על ידי הפעלת פתרון ה- PCR למיקרו-ערוץ הממוקם על תנורי חימום המוגדרים בטמפרטורות שונות.
מכיוון של- CE יתרונות רבים, כגון רזולוציה גבוהה, מהירות גבוהה ויכולת שחזור מעולה, הוא הפך לכלי פופולרי במעבדה לניתוח חומצות גרעין וחלבונים. עם זאת, רוב המעבדות, במיוחד המעבדות בעולם המתפתח, אינן יכולות להרשות לעצמן טכנולוגיה זו בגלל מחירו הגבוה של מכשיר CE. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים כיצד לייצר את השבב המיקרופלואידי CF-PCR וכיצד לבנות מערכת CE רב-תכליתית במעבדה.
כמו כן, אנו מדגימים את תהליך ההגברה של Escherichia coli על ידי מערכת CF-PCR, ואת איתור מוצרי ה-PCR על ידי מערכת CE. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים צריכים להיות מסוגלים לייצר שבבים מיקרופלואידים, להכין פתרון PCR, לבנות מערכת CF-PCR להגברת חומצות גרעין, ולהקים מערכת CE פשוטה, אפילו עם משאבים מוגבלים, כדי להפריד מקטעי DNA. חממו את פרוסת הסיליקון בטמפרטורה של 200 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי להסיר את הלחות.
יש להוציא מיליליטר אחד של SU-8 2075 photoresist לכל אינץ' של רקיק. סובב אותו על פרוסת הסיליקון באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 עד 10 שניות עם תאוצה של 100 סל"ד לשנייה, ולאחר מכן ב 2, 000 סל"ד במשך 30 שניות עם תאוצה של 500 סל"ד לשנייה. אופים אותו ברכות, בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, ו-95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
הגדר 150 עד 215 מיליג'ול לסמ"ר כאנרגיית החשיפה של מכונת הפוטוליתוגרפיה, וחרוט את התבנית המעוצבת על התנגדות הפוטו עם מסיכת פוטוליתוגרפיה. מניחים את פרוסת הסיליקון והמסכה מוכנים לחשיפה. לאחר החשיפה, אופים את הוופל בטמפרטורה של 18 מעלות במשך שתי דקות, ו-95 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.
טבלו את פרוסת הסיליקון בפתרון פיתוח כדי להסיר עודפי פוטו-התנגדות, והוציאו אותו כאשר ניתן לראות את המיקרו-ערוצים. לאחר מכן השתמש באיזופרופנול כדי לשטוף את פתרון המפתח השיורי. מערבבים את פולידימתילסילוקסאן פרפולימר וסוכן ריפוי ביחס של 10 ל -1.
יוצקים את תמיסת PDMS המעורבת לתבנית המשוכפלת וממצקים אותה בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. חבר את השבב המיקרופלואידי PDMS על שקופית לאחר ההפעלה באמצעות שואב פלזמה, ומצק אותם ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בהקדם האפשרי. השתמש מערבול מערבולת וצנטריפוגה כדי להבטיח שהריאגנטים מעורבבים היטב.
הכינו צינור צנטריפוגה. ראשית להוסיף מים לצינור הצנטריפוגה. לאחר מכן הוסף את תבנית ה- DNA, פריימר, חיץ, תערובת dNTP, Tween 20, PVP, ולבסוף הוסף את ה- DNA פולימראז.
לבסוף, מערבבים את התמיסה על ידי מערבולת. הכינו שני תנורי חימום קרמיים PTC, שני ממסרי מצב מוצק, שני בקרי טמפרטורה, שני חיישני טמפרטורה וכבל חשמל. חבר את תנור החימום לממסר מצב מוצק.
חבר את ממסר מצב מוצק לבקר הטמפרטורה PID. לאחר מכן חבר את בדיקת חיישן הטמפרטורה לתחתית שני תנורי החימום, וחבר את המסוף לבקר הטמפרטורה PID. לבסוף, חבר שני ממסרי מצב מוצק בסדרה, וחבר את כבל החשמל.
הדפס בתלת-ממד חריץ עבור שני תנורי החימום ושמור את תנורי החימום באותו מישור. מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני תנורי החימום. הכינו משאבת מזרק ומזרק, ולאחר מכן תקנו את המזרק על משאבת המזרק.
חברו צינור סיליקון באמצעות מזרק, וחברו מחט פלדה לחלק העליון של צינור הסיליקון. הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic. מניחים קצה פיפטה בשקע השבב כדי לאסוף את מוצרי ה- PCR.
השתמש בספק כוח במתח גבוה כדי ליצור שדה חשמלי פועם. תראה, זה ספק כוח מתח גבוה. אלה אלקטרודות חיוביות ושליליות.
השתמש במנורת כספית כמקור אור וסנן את אורך גל העירור ממנורת הכספית דרך מסנן. מניחים את הנימים על במת המיקרוסקופ. לאסוף את פליטת פלואורסצנטיות עם המטרה, ולאחר מכן לזהות אותו על ידי צינור photomultiplier.
זה המיקרוסקופ שלנו וזה הנימים שלנו. עכשיו אנחנו מדליקים את האור בתנאי חדר חשוך. אור עירור נאסף על ידי המטרה.
השתמש בתוכנת LABVIEW שפותחה בעצמה כדי לשלוט בספק הכוח ולהשלים את איסוף הנתונים. הגדר מראש את הטמפרטורה של תנורי החימום של מערכת CF-PCR ב 65 מעלות צלזיוס ו 95 מעלות צלזיוס. מניחים את השבב המיקרופלואידי על שני גושי החימום.
הכנס את קצה צינור הסיליקון לצינור צנטריפוגה המכיל 50 מיקרוליטר של תמיסת PCR. משוך את בוכנת המזרק כדי למשוך לאט את התמיסה. תקן את המזרק על משאבת מזרק.
הכנס את מחט הפלדה לתוך הכניסה של שבב microfluidic. הגדר את קצב הזרימה של המשאבה ל -10 מיקרוליטר לדקה ולחץ על לחצן התחל כדי לדחוף את התמיסה במיקרו-ערוץ בכניסת השבב. לאסוף את מוצרי PCR בשקע של שבב microfluidic.
הכינו נימים באורך כולל של 8 ס"מ ובאורך אפקטיבי של 6 ס"מ. הכינו את מאגר ההפרדה על ידי ערבוב של 100 מיקרוליטר של 1% HEC, שני מיקרוליטרים של 100x SYBR Green ו-98 מיקרוליטר של מים אולטרה-טהורים כדי לקבל 0.5% HEC המכיל 1x SYBR Green. מלאו את הנימים במאגר ההפרדה המוכן באמצעות משאבת ואקום.
הזן את מתח ההזרקה ואת זמן ההזרקה בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והמתן עד שמוצרי ה- PCR יוכנסו אלקטרודינמית לנימים. הזן את מתח ה- DC בממשק התוכנה, לחץ על לחצן התחל והפעל את האלקטרופורזה בחוזק שדה חשמלי של 100 וולט לסנטימטר. לחץ על לחצן העצירה לאחר שכל מקטעי ה- DNA מופרדים בנימים.
שטפו את הנימים במים מעוקרים למשך דקה לאחר כל ריצה. תמונה זו מייצגת את האלקטרופרוגרמה של מוצרי PCR וסמני DNA. תחילה הגברנו את גן המטרה של Escherichia coli במערכת CF-PCR, ותמיסת ה-PCR ארכה כ-10 דקות ו-30 שניות מהכניסה ליציאת השבב.
גודל אמפליקון המטרה של Escherichia coli היה 544 bp. לאחר מכן, ניתחנו את מוצרי ה- PCR המוגברים במערכת האלקטרופורזה הנימית. בנוסף, ביצענו גם אלקטרופורזה נימית של סולם DNA של 100 bp באותם תנאי ניסוי.
ניתן להעריך את גודל מוצר ה- PCR על פי האלקטרופרוגרמה של סולם ה- DNA. כל ניסוי בוצע שלוש פעמים לצורך שחזור. הנתונים בתמונה זו מראים כי השיא המתאים למוצרי PCR של Escherichia coli נצפה לאחר ההפרדה, וזמן הנדידה של מוצרי PCR בשבב המיקרופלואידי היה עקבי עם זה שבמחזור תרמי.
הן PCR והן CE הן שתי ביוטכנולוגיות פופולריות בניתוח חומצות גרעין. מאמר זה מתאר את ההגברה של Escherichia coli ואת הזיהוי של מוצרי PCR באמצעות מערכות CF-PCR ו- CE, שתיהן מובנות בתוך החברה. גן המטרה של Escherichia coli הוגבר בהצלחה תוך 10 דקות, ומקטעי ה- DNA הקטנים מ -1, 500 bp הופרדו תוך שמונה דקות.
כמו כן, מערכת CF-PCR המבוססת על השבב המיקרופלואידי ומערכת CE שהוצגה בעבודה זו קלה לייצור, ועשויה להציע דרך פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה. הוא יכול להגביר ולזהות רק דגימה אחת בכל פעם, מה שמגביל את היישום הרחב שלו. לכן, הפיתוח של מערך שבבים משולב CF-PCR ו- CE microfluidic לזיהוי תפוקה גבוהה של פתוגנים עדיין בדרך.
