이 프로토콜은 미세유체 칩을 기반으로 연속 유동 중합효소 사슬 시스템을 구축하는 방법과 실험실에서 모세관 전기영동 시스템을 구축하는 방법을 설명합니다. 실험실에서 핵산을 분석하는 간단한 방법을 제시합니다. 중합효소 연쇄 반응은 표적 유전자의 증폭을 위해 채택된 전통적인 방법입니다.
그러나 기존 PCR은 저온 변이 효율로 인해 시간이 많이 걸립니다. 본 연구는 미세유체 칩을 기반으로 한 연속 유동 PCR 시스템을 제안한다. 증폭 시간은 PCR 용액을 다른 온도로 설정된 히터에 배치된 마이크로 채널로 실행하여 크게 줄일 수 있습니다.
CE는 고분해능, 고속 및 우수한 재현성과 같은 많은 장점을 가지고 있기 때문에 핵산 및 단백질 분석을 위한 실험실에서 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 그러나 대부분의 실험실, 특히 개발 도상국의 실험실은 CE 기기의 높은 가격 때문에 이 기술을 감당할 수 없습니다. 여기에서는 CF-PCR 미세유체 칩을 제조하는 방법과 실험실에서 다용도 CE 시스템을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 간략하게 설명했습니다.
또한 CF-PCR 시스템에 의한 대장균 증폭 과정과 CE 시스템에 의한 PCR 산물 검출 과정을 시연합니다. 이 프로토콜에 설명된 절차를 따르면 사용자는 미세유체 칩을 제조하고, PCR 용액을 준비하고, 핵산 증폭을 위한 CF-PCR 시스템을 구축하고, 제한된 리소스로도 간단한 CE 시스템을 설정하여 DNA 단편을 분리할 수 있어야 합니다. 실리콘 웨이퍼를 섭씨 200도에서 25분 동안 가열하여 수분을 제거합니다.
웨이퍼 인치당 1밀리리터의 SU-8 2075 포토레지스트를 디스펜싱합니다. 초당 100 rpm의 가속도로 5-10 초 동안 500 rpm에서 스핀 코터를 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 회전시킨 다음 초당 500 rpm의 가속도로 30 초 동안 000 rpm에서 회전시킵니다. 섭씨 65도에서 3분, 섭씨 95도에서 15분간 부드럽게 굽습니다.
포토리소그래피 기계의 노출 에너지로 제곱센티미터당 150-215밀리줄을 설정하고 포토리소그래피 마스크로 포토레지스트에 디자인된 패턴을 조각합니다. 실리콘 웨이퍼와 마스크를 노출할 준비가 되도록 놓습니다. 노출 후 웨이퍼를 섭씨 65도에서 2분, 섭씨 95도에서 7분 동안 굽습니다.
실리콘 웨이퍼를 현상액에 담가 과도한 감광액을 제거하고 마이크로 채널이 보이면 꺼냅니다. 그런 다음 이소프로판올을 사용하여 잔류 현상액을 헹굽니다. 폴리디메틸실록산 프리폴리머와 경화제를 10:1의 비율로 혼합합니다.
혼합된 PDMS 용액을 복제 금형에 붓고 섭씨 80도에서 60분 동안 응고시킵니다. 플라즈마 클리너를 사용하여 활성화 후 슬라이드에 PDMS 미세유체 칩을 접착하고 가능한 한 빨리 섭씨 80도에서 30분 동안 응고시킵니다. 와류 믹서와 원심분리기를 사용하여 시약이 잘 혼합되었는지 확인합니다.
원심분리기 튜브를 준비합니다. 먼저 원심분리기 튜브에 물을 추가합니다. 그런 다음 DNA 템플릿, 프라이머, 완충액, dNTP 혼합물, Tween 20, PVP를 추가하고 마지막으로 DNA 중합효소를 추가합니다.
마지막으로 와류로 용액을 혼합합니다. PTC 세라믹 히터 2개, 솔리드 스테이트 릴레이 2개, 온도 컨트롤러 2개, 온도 센서 2개, 전원 코드 1개를 준비합니다. 히터를 솔리드 스테이트 릴레이에 연결합니다.
솔리드 스테이트 릴레이를 PID 온도 컨트롤러에 연결합니다. 그런 다음 온도 센서 프로브를 두 히터의 바닥에 부착하고 단자를 PID 온도 컨트롤러에 연결합니다. 마지막으로 두 개의 솔리드 스테이트 릴레이를 직렬로 연결하고 전원 코드를 연결합니다.
두 히터의 슬롯을 3D 인쇄하고 히터를 동일한 평면에 유지합니다. 두 히터에 미세 유체 칩을 놓습니다. 주사기 펌프와 주사기를 준비한 다음 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.
실리콘 튜브를 주사기로 연결하고 강철 바늘을 실리콘 튜브 상단에 연결합니다. 강철 바늘을 미세 유체 칩의 입구에 삽입합니다. 칩의 출구에 피펫 팁을 놓아 PCR 산물을 수집합니다.
고전압 전원 공급 장치를 사용하여 펄스장 전기장을 생성합니다. 보세요, 이것은 고전압 전원 공급 장치입니다. 이들은 양극과 음극입니다.
수은 램프를 광원으로 사용하고 필터를 통해 수은 램프의 여기 파장을 필터링합니다. 모세관을 현미경 스테이지에 놓습니다. 대물렌즈로 형광 방출을 수집한 다음 광전자 증배관으로 검출합니다.
이것은 우리의 현미경이고 이것은 우리의 모세관입니다. 이제 어두운 방 조건에서 조명을 켭니다. 여기광은 대물렌즈에 의해 수집됩니다.
자체 개발한 LABVIEW 소프트웨어를 사용하여 전원 공급을 제어하고 데이터 수집을 완료하십시오. CF-PCR 시스템의 히터 온도를 섭씨 65도, 섭씨 95도로 미리 설정합니다. 두 개의 가열 블록에 미세 유체 칩을 놓습니다.
실리콘 튜브의 끝을 50 마이크로리터의 PCR 용액이 들어 있는 원심분리기 튜브에 삽입합니다. 주사기 플런저를 당겨 용액을 천천히 빼냅니다. 주사기 펌프에 주사기를 고정합니다.
강철 바늘을 미세 유체 칩의 입구에 삽입합니다. 펌프의 유량을 분당 10마이크로리터로 설정하고 시작 버튼을 눌러 마이크로칩 입구의 마이크로채널에서 용액을 밀어냅니다. 미세유체 칩의 출구에서 PCR 산물을 수집합니다.
총 길이 8cm, 유효 길이 6cm의 모세관을 준비합니다. 100마이크로리터의 1%HEC, 2마이크로리터의 100x SYBR Green, 98마이크로리터의 초순수를 혼합하여 1x SYBR Green을 포함하는 0.5%HEC를 얻어 분리 완충액을 준비합니다. 진공 펌프를 사용하여 준비된 분리 완충액으로 모세관을 채웁니다.
소프트웨어 인터페이스에 주입 전압과 주입 시간을 입력하고 시작 버튼을 클릭한 다음 PCR 산물이 모세관에 전기역학적으로 도입될 때까지 기다립니다. 소프트웨어 인터페이스에 DC 전압을 입력하고 시작 버튼을 클릭한 다음 100cm의 전기장 강도에서 전기 영동을 실행합니다. 모든 DNA 조각이 모세관에서 분리된 후 중지 버튼을 클릭합니다.
각 실행 후 1분 동안 멸균수로 모세관을 씻어내십시오. 이 그림은 PCR 산물과 DNA 마커의 전기페로그램을 나타냅니다. 먼저 CF-PCR 시스템에서 대장균의 표적 유전자를 증폭하고, PCR 용액은 칩의 입구에서 출구까지 약 10분 30초가 걸렸습니다.
대장균의 표적 앰플리콘의 크기는 544bp였다. 그 후, 모세관 전기영동 시스템에서 증폭된 PCR 산물을 분석했습니다. 또한 동일한 실험 조건에서 100bp DNA ladder의 모세관 전기영동도 수행했습니다.
PCR 산물의 크기는 DNA 사다리의 전기 페로그램에 따라 평가할 수 있습니다. 각 실험은 재현성을 위해 세 번 수행되었습니다. 이 그림의 데이터는 분리 후 대장균의 PCR 산물에 해당하는 피크가 관찰되었으며 미세유체 칩에서 PCR 산물의 이동 시간이 열 순환기에서의 이동 시간과 일치했음을 보여줍니다.
PCR과 CE는 모두 핵산 분석에서 널리 사용되는 두 가지 생명 공학입니다. 이 논문은 사내에 내장된 CF-PCR 및 CE 시스템을 사용하여 대장균의 증폭과 PCR 산물의 검출에 대해 설명합니다. 대장균의 표적 유전자는 10분 이내에 성공적으로 증폭되었고, 1, 500 bp 미만의 DNA 단편은 8분 이내에 분리되었다.
또한, 미세유체 칩을 기반으로 하는 CF-PCR 시스템과 본 연구에서 소개된 CE 시스템은 제작이 용이하며, 실험실에서 핵산 분석을 위한 간단한 방법을 제공할 수 있습니다. 한 번에 하나의 샘플만 증폭하고 검출할 수 있어 광범위한 적용이 제한됩니다. 따라서 병원체의 고처리량 검출을 위한 통합 CF-PCR 및 CE 미세유체 칩 어레이의 개발은 여전히 진행 중입니다.
