בווידאו, אנו מציגים פרוטוקול להקפאה-שבירת בועיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי סרטן שלפוחית השתן במבחנה. בועיות חוץ-תאיות הן בועיות מוגבלות בממברנה שמקורן בתאים משתחררות לחלל חוץ-תאי ויש להן תפקיד בתקשורת הבין-תאית. בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות, אנו מבחינים בשלוש אוכלוסיות, אקסוזומים, מיקרו-וסיקלים וגופים אפופטוטיים, הנבדלים זה מזה לפי מקורם, גודלם והרכבם המולקולרי.
ההרכב המולקולרי של שלפוחיות חוץ-תאיות משקף את הפרופיל המולקולרי של התא התורם ומפריע לתהליכים ביולוגיים בתא המקבל. עם זאת, הרכב הממברנה המגבילה של שלפוחיות התאים הוא חיוני לאינטראקציה עם קרום התא המקבל. כדי לנתח את הארגון של הממברנה המגבילה, יש לבודד תחילה שלפוחיות חוץ-תאיות, ולאחר מכן לגשת לטכניקת הקפאה-שבר.
Freeze-fracture היא טכניקה מיקרוסקופית של אלקטרונים המוקדשת לחקר הארגון הדו-ממדי של ממברנות ביולוגיות, כולל שלפוחיות. השלבים של שבירת הקפאה הם הקפאה מהירה של הדגימה, שבירת הדגימה, יצירת העתק של המשטח הקפוא-שבור, וניקוי ההעתק כדי להסיר חומרים ביולוגיים. העתקים מתוארים לבסוף באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
מטרתנו הייתה להשתמש בטכניקת הקפאה-שבר כדי לאפיין מיקרו-סיביות במונחים של צורה, גודל והרכב הממברנה. התחילו עם תאים גדלים באינקובטור התאים. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את השונות והמפגש שלהם.
אספו מדיית תרבות עם מיקרו-וסיביקלים לתוך צינורות, וצנטריפוגות ב-300 גרם-כוחות למשך 10 דקות. לאסוף סופרנטנט. לאחר מכן, צנטריפוגה סופרנאטנט ב 2000 g-כוחות ו 10, 000 g-forces.
לאחר מכן, התבונן בקצה הצינור עבור כדור לבנבן המציין microvesicles. בזהירות להסיר את supernatant. הוסיפו 1.5 מיליליטרים של PBS, והשענו מחדש את הכדור המכיל מיקרו-סיביות.
ואז צנטריפוגה ב 10, 000 g-כוחות. שימו לב לכדור הלבן. הסר את ה-supernatant, והוסף בעדינות את ה-fixative.
השאירו למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הקיבוע, והוסף מאגר כביסה כדי לשטוף את הכדור מבלי להשעות אותו מחדש. יוצאים ל-10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
מוציאים את מאגר הכביסה, ומוסיפים 30% גליצרול לכדור. להשעות מחדש את הכדור לתרחיף הומוגני, ולדגום במשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. מכינים נושאי נחושת נקיים עם בור מרכזי ומפתחים בקבוקון עם חנקן זועף ונוזלי.
תחת מיקרוסקופ, להעביר את הדגימה לתוך הבור המרכזי של נושאת נחושת. מערבבים פריון מוצק כדי להפוך לאלכוהולי. קחו את הטבעת החיצונית של המנשא עם פינצטה והשקיעו אותה בפראון מקורר.
לאחר שמונה שניות מעבירים במהירות את המוביל לפתח בקבוקון עם חנקן נוזלי. מארק קריו מרושע וצונן אותו. תחת חנקן נוזלי לאסוף את הנשאים לתוך התזזית, לסגור אותו, ולאחסן במיכל החנקן הנוזלי עד להקפאת השבירה.
הכן יחידת שבר הקפאה בהתאם להוראות ההפעלה של היצרנים. הפעל את מערכת הוואקום וצמצם את תא היחידה למינוס 150 מעלות צלזיוס. העבר נשאי נחושת עם דגימה קפואה ליחידת הפיצול המקפיאה.
הגדר את טמפרטורת הסכין למינוס 100 מעלות צלזיוס והמתין לוואקום. התחילו לחתוך את הדגימה על ידי הפעלת תנועה ממונעת של הסכין עד שמשטח הדגימה יהיה חלק. לשבירה לכבות את התנועה הממונעת של הסכין ולהמשיך עם שליטה ידנית איטית של הסכין.
המשך עם הצללת הפלטינה בזווית של 45 מעלות. הפעל מתח גבוה והגבר את הזרם לאקדח הפלטינה. ניצוצות של פלטינה צריכים להתחיל לצלול את המדגם.
פיקוח על מיקום הפלטינה על צג עובי גביש הקוורץ. העובי המומלץ של פלטינה הוא 2.5 ננומטר. כבה את הזרם ואת המתח הגבוה.
המשך עם הצללת פחמן בזווית של 90 מעלות. הפעל מתח גבוה והגבר את הזרם לאקדח פחמן. ניצוצות של פחמן צריכים להתחיל לצלול על הדגימה.
כאשר מתקבלים 2.5 ננומטרים של פחמן, כבו את הזרם ואת המתח הגבוה. העבר את הדגימות האלה עם ההעתקים מיחידת השבר המקפיא ללוחית בת 12 שסתומים מלאה במים מזוקקים כפולים. העתקים יצופו על פני המים בזמן שהמובילים ישקעו.
מעבירים העתקים עם לולאת תיל לצלחת בת 12 שסתומים מלאה בנתרן היפוקלוריט ואינקובצים למשך הלילה. יש לשטוף העתקים במים מזוקקים כפולים. אספו אותם על סורג רשת נחושת TM ותנו להם להתייבש באוויר במשך שעתיים.
השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת כדי לצלם העתקים ולקבל מיקרוגרפים. לפרשנות מדויקת של העתקים ומיקרוגרפים, פעל לפי הנחיות להתמצאות נכונה במינוח. ניתוחים של העתקים הראו כי תווך מבודד-מותנה הכיל חלק מועשר של שלפוחיות.
שלפוחיות מבודדות נאספו באשכולות של שלושה או יותר או יותר או מפוזרים בנפרד. בועיות היו בצורת כדורית. קוטר הבועיות התאים לקוטר המיקרו-וסיקלים.
שבירת הקפאה חשפה גם ארגון דו-ממדי של קרום המיקרו-ווסיקלים. לפאזה האקסופלסמית של המיקרו-וסיקלים היה מראה חלק ואחיד, בעוד שבשלב הפרוטופלסטים צפינו בחלקיקים בין-ממברניים. חלקיקים בין-ממברנות הופיעו באופן ספורדי, מה שמרמז על כך שמיקרו-וסיקלים שבודדו מתאי החומר הסרטני מכילים רק כמות נמוכה של חלבוני ממברנה או מכלולים חלבוניים.
לסיכום, טכניקת הקפאה-שבר המשמשת בפרוטוקול המוצג מוכיחה את עצמה כטכניקה אופטימלית לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות וניתן להשתמש בה להערכת אוכלוסיות אחרות של שלפוחיות חוץ-תאיות. יתרון מכריע של טכניקת הקפאה-שבר הוא כוחה לפתור את הארגון הפנימי של הממברנה המגבילה את הבועיות, הקובעת את התפקוד הביולוגי של שלפוחיות חוץ-תאיות.
