פרוטוקול זה מראה כי קרינה משפיעה על תכונות מטריצה חוץ תאית של רקמת שומן כרית שומן מומרי מורין. תוספת הקרינה במודל דקלולריזציה לא נעשתה בעבר. טכניקה זו משתמשת במספר שלבי כביסה שכל אחד מהם משרת מטרה כימית ייחודית בתהליך ההדקולריזציה.
הספציפיות של טכניקה זו מאפשרת שטיפות כימיות עדינות יותר, כדי לשמר טוב יותר את תכונות הרקמה. הישנות סרטן השד מתרחשת לאחר הטיפול, במיוחד במקרים שליליים משולשים. הערכת האופן שבו המטריצה החוץ-תאית המוקרנת משנה את התנהגות תאי הגידול תוביל לתגליות חשובות על מנגנוני הישנות.
לאחר הקרנה של דגימות, באמצעות מקור צסיום, להעביר את MFP מוקרן של להשלים את התקשורת RPMI לתוך ארון biosafety. מלאו 6 ס"מ או 10 ס"מ במנות עם מספיק מדיה כדי להטביע את ה-MFP. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, במשך יומיים.
ראשית, מניחים את ה-MFP במנות של שישה סנטימטרים עם חמישה מיליליטר של פתרון טריפסין-EDTA. מרססים ומנגבים את הכלים ב-70% אתנול ודגירה ב-37 מעלות במשך שעה. השתמש מסננים 0.7 מיליליטר לשטוף את MFP של עם מים deionized, על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים.
השתמש מטליות לעסות באופן ידני את הרקמה בין שטיפות. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. מניחים את הרקמות המיובשת בסקילר טרום-אוטולאבי, המכיל בר ערבוב בגודל מתאים ומכסים את הרקמות ב-60 מיליליטר של 3%t-octylphenoxypolyoxyethanol לגרם של רקמה.
מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז לזרוק את תכולתו של המקה לתוך מסננת. לשטוף את המק עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות.
חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש במדפים לעסות ידנית את הרקמה בין שטיפות. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול. מניחים את הרקמות ואת הסורגים מערבבים בחזרה לתוך אותם מקורים לכסות אותם עם 60 מיליליטר של 4% חומצה deoxycholic לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לזרוק את תכולת הבקבוק לתוך מסננת רשת, לשטוף את המקם עם מים deionized ויוצקים את זה על הרקמות. חזור על תהליך שטיפה זה פעמיים נוספות, הקפד להשתמש במדפים לעסות ידנית את הרקמה בין שטיפות.
ייבשו בקצרה את הרקמה הרכה על מגבון משימה עדין ושקלו אותה. מניחים את הרקמות היבשות באותה מקור, יחד עם מים טריים deionized, בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מכסים את הפקע בחוזקה עם סרט פרפין ומשאירים ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
למחרת לנקז את תכולת התוך המקור לתוך מסננת, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לאחר מכן, מניחים את ה-MFP באותו מקור עם בר ערבוב בגודל מתאים. מכסים את הרקמה עם 60 מיליליטר של פתרון המכיל 4%אתנול ו 0.1% חומצה peracetic לגרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. השלך את תכולת הקוסם לתוך מסננת 0.7 מילימטר. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה ולמקם את התוכן בחזרה לתוך התוך המק.
לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של 1X PBS לגרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה עוד פעם אחת.
לאחר מכן, השלך את תכולת הקוסם לתוך מסננת 0.7 מילימטר. באמצעות מלקחיים, לעסות באופן ידני את הרקמה ולמקם את התוכן בחזרה לתוך המק. לשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לכל גרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על כל תהליך הכביסה הזה עוד פעם אחת. לייבש בקצרה את הרקמה שטף על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו.
לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת ולהשתמש מדפים לעסות באופן ידני את הרקמה. מניחים את התוכן בחזרה לתוך הקנים ולכסות את הרקמות עם 60 מיליליטר של 100% n-propanol לגרם של רקמה. מערבבים בטמפרטורת החדר במשך שעה.
לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו. לזרוק את הרקמה ואת התוכן לתוך מסננת 0.7 מילימטר ולהשתמש מטלות לעסות את הרקמה באופן ידני. מניחים את התוכן בחזרה לתוך המקור ולשטוף את הרקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מיליליטר של מים deionized לגרם של רקמה.
מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. חזור על תהליך שטיפה זה שלוש פעמים. לאחר מכן, לייבש בקצרה את הרקמה על לנגב משימה עדינה ולשקול אותו.
מעבירים את הרקמה לצינור 15 מיליליטר מסומנים ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס שליליות במהלך הלילה. ראשית, למלא מיכל רדוד עם חנקן נוזלי. מוציאים את הדגימות מהמקפיא ומשקללים כל MFP ליופילי.
מניחים דגימה אחת במכתש, משתמשים בכפפה קריוגנית כדי להחזיק את המרגמה בחנקן הנוזלי. לאחר מכן, השתמש עלה, מחובר מקדחה ידנית, כדי לטחן את המדגם. טחנה במרווחים של דקה אחת כדי לבדוק את ההתקדמות ולהסיר את היד הכפפות מהחנקן הנוזלי.
חזור על תהליך כרסום זה עבור כל הדגימות, הקפד לרסס ולנגב את המרגמה ועלי עם אתנול בין כל מדגם. לאחסן את דגימות אבקת 15 צינורות מיליליטר ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד מוכן לשימוש. כדי להתחיל, להסיר את הדגימות מהמקפיא ולהפשיר בטמפרטורת החדר.
בזמן שהדגימות מפשירות, מערבבים פפסין לחומצה הידרוכלורית כדי ליצור פתרון פפסין-HCL. לאחר מכן, הוסיפו אבקת דגימה ופתרון פפסין-HCL לצינור של 15 מיליליטר, הוסיפו בר ערבוב קטן ומערבבים במשך 48 שעות. לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח במשך חמש דקות.
הוסף PBS 10X לכל מדגם, כך הפתרון הסופי יש ריכוז של PBS 1X. לאחר מכן, להוסיף 10% נפח / נפח, 0.1 נתרן הידרוקסידי טוחן לכל פתרון, כדי להגיע pH 7.4, באמצעות נייר pH כדי לבדוק כל פתרון בנפרד. באמצעות פתרון ג'ל pH 7.4, להשתמש מחדש GFP גלולה ו luciferase שכותרתו 4T1 תאים לריכוז של 500, 000 או 1, 000, 000 תאים למיליליטר של פתרון ג'ל.
הוסיפו 16 מיקרוליטרים של תוסף תא ג'ל לכל באר של מגלשת תאים של 16 בארות ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיית RPMI מלאה לכל באר. ממשיכים להתהגר ב-37 מעלות במשך 48 שעות.
לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להתבונן בתאים באורך גל של 519 ננומטר ואורך גל פליטה של 618 ננומטר. במחקר זה, אפקטים קרינת רקמות נורמלית נחקרים, באמצעות הידרוג'ל מטריצה חוץ תאית. המטוקסילין וכתמי אאוסין משמשים לאישור דקלולריזציה, באמצעות אובדן גרעינים ועקבות אחרות של DNA.
בעוד כתמי שמן אדום O משמש כדי להעריך את תוכן השומנים ולאשר את השמירה של מורפולוגיה דיפאסיט. המאפיינים הריאולוגיים של הידרוג'ל ECM מוערכים ב 37 מעלות צלזיוס. מודולוס האחסון גבוה יותר ממודולוס ההפסד לכל התנאים, ומדגים היווצרות הידרוג'ל יציבה.
GFP ו לוציפראז שכותרתו 4T1 תאי קרצינומה קמע לאחר מכן אנקפסולציה הידרוג'לים. התפשטות התא נבדקת על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, על ידי מדידות illuminescence וכתמי כדאיות, 48 שעות לאחר אנקפסולציה. הידרוג'ל מוקרן להראות מגמה גוברת התפשטות תאים סרטניים.
פלואידין תולה משמש כדי לדמיין F-Actin בתאים אנקפסולציה. זכור לקרר את המרגמה לפני הצבת הרקמה בתוך הטחנה, מרגמה חמה עלולה להוביל כרסום שלם. נקוט זהירות בעת טיפול n-propanal ופפסין, רק n-propanal פתוח וסוכנים decellularizationary אחרים תחת מכסה המנוע כימי.
במידת האפשר, לשקול את הפפסין מתחת למכסה המנוע הכימי, כפי שקיים סכנה של שאיפה. שינויי הרכב ECM לאחר הקרנה ודקלולריזציה ניתן להעריך באמצעות ספקטרומטריית מסה ספקטרוסקופיה אמן. בנוסף, ניתן לנתח את מבנה הסיבים של הידרוג'לים ECM על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
שיטה זו יש פוטנציאל להיות מורחב כדי לבחון את ההשפעות של קרינה על, לא רק תאים סרטניים אלא גם תאים חיסוניים, כמו גם רקמות לחוות נזק לקרינה, כתוצאה של טיפול. טכניקת דקלולריזציה זו תאפשר לחוקרים להעריך את תכונות המטריצה החוץ תאית של הרקמה בעקבות קרינה, שהיא אפשרות טיפול חשובה ברוב סוגי הסרטן.
