שיטה זו מספקת אסטרטגיה יעילה להכנת פיגומים תפקודיים למחקר גידול בעצמות. Decellularized מטריצת העצם extracelullar, הראה serocompatibility משתנה להישרדות ופעילויות של תאים osteosarcoma. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתרבות התאים אוסטאוסרקומה במטריצה המופקת מעצם מראה מורפולוגיה הטרוגנית מאוד דומה להיסטופתולוגיה קלינית של אוסטאוסרקומה.
השיטה מספקת מודל אידיאלי לחקירת ההתפתחות, התקדמות הרגישויות לתרופות של גידולים בעצמות, כגון אוסטאוסרקומה, סרקומה יואינג, וגידולים ממאירים אחרים גרורות לעצם. כדי להתחיל, להשיג ארבעה עד שישה שבועות BALB / c עכברים, לאחר המתת דם עכבר באמצעות מספריים כירורגיים סטריליים, לחתוך שוקית טרייה, השוקה, ועצם הירך מאיבר אחורי. בעזרת פינצטה, לקלף את רקמת האפיתל, ולאחר מכן להסיר כמה שיותר של הרקמה הרכה ככל האפשר.
לשטוף את עצמות הרגל עם פתרון PBS סטרילי 10 mM פעמיים כדי להסיר דם בצלחת שישה סנטימטרים. טובל את העצמות בצלחת עם 75% אתנול במשך שלוש דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS פעמיים. אחסן את העצמות הנקיות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר עם צינור PBS סטרילי ב-80 מעלות צלזיוס.
להפשיר את העצמות הקפואות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להקפיא שוב ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. חשוף את העצמות ליותר משני מחזורי הפשרת הקפאה עבור תותבת תאים ופירוק רקמות. לאחר מכן, מניחים את העצמות בצינור צנטריפוגה סטרילי 50 מיליליטר מלא 0.5 HCl נורמלי דגירה לילה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית עם רעידות עדינות כדי להבטיח כיסוי מלא ואפילו של העצמות.
לאחר דקלציציה, decant תווי חומצה הידרוכלורית לחלוטין לשטוף את העצמות תחת מים זורמים במשך שעה אחת. לאחר מכן, השתמש במים מזוקקים כדי לשטוף את העצמות פעמיים במשך 15 דקות לכל לשטוף על שייקר מסלולית. לגמרי decant הפתרון.
כדי לחלץ את השומנים בעצמות demineralized, מניחים את העצמות בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר עם תערובת 1:1 של מתנול וכלורופורם. לעטוף את הצינור עם נייר אלומיניום, כדי למנוע אור למניעת פירוק כלורופורם. ולשים את הצינור על שייקר מסלולי במשך שעה אחת.
לאחר מכן, השתמש פינצטה כדי להעביר את העצמות לתוך צינור אחר של מתנול עם נייר כסף במשך 30 דקות. מוציאים את מתנול לחלוטין, ולשטוף עם מים מזוקקים פעמיים במשך 15 דקות על שייקר מסלולית. דקאנט סופי לשטוף מים ולהמשיך במצב סטרילי.
שוטפים את העצמות בצלחת של שישה סנטימטרים עם PBS סטרילי במשך שלוש דקות. הוסף 40 מיליליטר של פתרון סטרילי 0.05%TE לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ועצמות אינקובט במשך 23 שעות באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. השלך את פתרון TE, ולשטוף פעמיים עם PBS סטרילי בתוספת 90 גרם / מ"ל אמפיצילין ו 90 g / mL kanamycin במשך 15 דקות כל אחד על שייקר מסלולית.
לאחר decanting לשטוף הסופי לחלוטין, לחדש שוב עם 40 מיליליטר של PBS סטרילי עם אנטיביוטיקה. יש לשטוף היטב במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר עם טלטולים עדינים כדי להשיג עיקור יעיל של חללים נקבוביים. לאחר מכן, להעביר את העצמות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר מלא PBS סטרילי עם אנטיביוטיקה.
מטריצת עצם חוץ תאית מוכנה ניתן לאחסן בארבע מעלות צלזיוס במשך חודשיים. לטבול BEM ב 75% אתנול בצלחת בעדינות ללחוץ את המנה ביד במשך 30 שניות. ואז לשטוף עם PBS במשך 30 שניות, פעמיים.
העבר את BEM על צלחת תרבות תאים נקייה של שש בארות. מוסיפים שני מיליליטר של תרבות שלמה בינונית לכל באר. דגירה BEM לילה באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
השג קווי תאים של מערכת ההפעלה האנושית ב-100 מיקרוליטרים של PBS מחומם מראש המכיל מחוון פנול אדום. השתמש פיפטה כדי להשעות את תאי מערכת ההפעלה עם ריכוז משוער של 1 פעמים 10 עד 5. לאחר שה- BEM ספוג לחלוטין במדיום, מאפיפים פרוקסימליים או דיסטליים, לנקב את המחט לחלל המדולרי של BEM ולהזריק תאי מערכת הפעלה לתוך BEM.
הדגירה את מודל OS-BEM למשך שעתיים לפחות באטמוספירה לחה של 5%פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס כדי להבטיח שהתאים המוזרקים ידבקו בחוזקה ב- BEM. לאחר מכן, להוציא את הצלחת מהחמה. מוסיפים מדיום תרבות מיליליטר אחד על הצלחת, ולשמור אותו באינקובטור לילה כדי לצפות לחלוטין את פני השטח של תרבות BEM.
העבר בעדינות את דגם ה- OS-BEM לתוך באר חדשה של צלחת שש בארות עם פינצטה סטרילית, והזן מחדש מדיום תרבות טרי מיליליטר אחד. תרבות המודל במשך 14 ימים באינקובטור. במהלך הדגירה בת 14 הימים, המשיכו לעקוב אחר צבע בינוני.
אם המדיום הופך לכתום, או אפילו לצהוב, רענן מיד את המדיום על ידי השלכת מחצית מהמדיום הישן והוספת מדיום חדש לשמירה על סביבה בריאה לתאי מערכת ההפעלה. המשך לעקוב אחר מצב התא תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטי ההפוך. כאשר תאי מערכת ההפעלה מתרחבים לצלחת, מעבירים בעדינות את דגם ה- OS-BEM ל באר חדשה נוספת עם פינצטה סטרילית.
לאחר תרבות של 14 יום, יש לשטוף בעדינות את דגם ה-OS-BEM באמצעות PBS כדי להסיר את מדיום התרבות. לאחר מכן העבר לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולהוסיף 10% פורמלין במאגר כדי לתקן לזיהוי היסטולוגי. לאחר demineralization ו decellularization, BEM נראה שקוף עם עמידות חזקה יותר ועקשנות לעומת עצם העכבר המקומי.
שאריות שרירים קטנות בחלל חלל מדולרי ניתן לראות בבירור. הדמיה שדה בהיר של העצם המקורית ואת BEM decellularized, מראה הסרה יסודית של גרעיני התא. המבנה הנקבובי הטבעי בסידור רשת הקולגן מתוחזק היטב ב- BEM נטול קפאין.
בנוסף, כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור קולגן I וקולאגן הרביעי מראה את המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ תאית נשמרים שוקה העכבר לאחר דקלולריזציה. במהלך התרבות של 14 יום, הן periosteum והן אנדוסטיום הם הסתננו על ידי התרחבות של תאי מערכת ההפעלה. תאי מערכת ההפעלה על BEM decellularized להראות מורפולוגיה הטרוגנית מאוד דומה תכונות ציטופתולוגיות של קטע מערכת ההפעלה.
ניתוח אימונוהיסטוכימי לאחר culturing במודל BEM במשך 14 ימים מראה יתרונות גדולים בתרבויות לטווח ארוך. כמו כן, תאי מערכת ההפעלה ותרבות BEM, גליצופרוטאין מטריצת עצם אקספרס מאוד, אשר ספציפי עבור מטריצה אוסטאואידית. מודל תלת מימדי זה של ויטרו שימש להדגים הטרוגניות פנוטיפית ומנגנון רגולטורי של דדיפרנטיות אוסטאוסרקומה עם הצלחה.
