וידאו זה מראה כיצד להעריך את האימונוגניות in vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול, או רכבים חשמליים, באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטת ההקרנה המתוארת במסמך זה קלה יחסית לביצוע וניתן להתאים אותה להגדרות שונות. בסרטן, זיהוי תנאים של שלפוחית חוץ-תאית אימונוגנית משחרר רלוונטיות תרגומית מסוימת.
ככזה, רכבים חשמליים אוטולוגיים עשויים לשמש כטיפולים מותאמים אישית נגד סרטן. מפגינה את החלק הראשון של ההליך תהיה טטיאנה Nedelko, עוזר טכני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל את ההכנה של מדיה תרבית התא הנדרשת עבור שלפוחית חוץ תאית, או EVs, לרוקן את רכבי בקר במדיה FCS על ידי ultracentrifugation ב 100, 000 פעמים g במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
להשליך את הכדור לאחר צנטריפוגה. לקצור את תאי מלנומה B16 מורין המבטאים אלילבומין, או B16-OVA תאים, מן התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, זרעו את התאים בריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר בתקשורת המרוקנת מרכב חשמלי.
לאחר מכן, לטפל בתאי B16-OVA עם 30 מיקרוגרם של oxaliplatin למיליליטר ודגר במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם דגימות בקרה מטופלות. לאחר 24 שעות, לאסוף את supernatant לצנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להשליך את הכדור לפני צנטריפוגה שוב ב 2, 000 פעמים g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת הכדור, לסנן את supernatant באמצעות מסנן קרום PVDF 220 ננומטר לתוך צינור טרי. לאחר מכן, לערבב 1 מיליליטר של supernatant עם 0.5 מיליליטר של ריאגנט בידוד exosome זמין מסחרית ספציפית. מערבולת ולהעביר את התערובת לתוך צינורות 1.5 מיליליטר, ואחריו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
למחרת, צנטריפוגה התערובת ב 10, 000 פעמים g במשך 60 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר השלכת בזהירות את supernatant, להסיר את הטיפות הנותרות על ידי הקשה על צינור 1.5 מיליליטר הפוך על מגבת נייר ועל ידי שאיפה דרך קצה דק של פיפטה מבלי לגעת גלולה EV בתחתית. resuspend את הכדור ב PBS קר על ידי צנרת למעלה ולמטה מבלי לגרד את הכדור עם הקצה.
לאחר מכן, בריכה את הרכבים החשמליים מכל הצינורות. אם לא משתמשים באופן מיידי, לאחסן את ההשעיות EV ב 80 מעלות צלזיוס בכלי סיליקון עד 28 ימים עד היישום. כדי לחסן כל עכבר בקבוצת הטיפול עם רכבים חשמליים מבודדים מ 4.0 x 10 לתאי B16-OVA החמישי, לערבב 5 microliters של השעיית EV עם 55 מיקרוליטרים של PBS קר.
לאחר מכן, מלא מזרקים רכובים עם מחטים 26 עד 30 מד עם 60 microliters של רכבים חשמליים מדוללים או PBS ולאחר מכן מיד לשים את המזרק על קרח. לחסן את הרכבים החשמליים או PBS תת עורית לתוך ההיבט המדיאלי של הירך של העכברים. חזור על החיסון לאחר שבעה ימים.
14 ימים לאחר הטיפול הראשון, להקריב את העכברים לכרות את הטחול. לאחר מכן, מועכים את הטחול החתוך עם מסננת תאים לחה של 100 מיקרומטר ובוכנה מפלסטיק של מזרק. לשטוף את תאי הטחול לתוך צינור 50 מיליליטר עם 5 עד 10 מיליליטר של RPMI מלא מגניב.
לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ב 400 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס לפני השלכת supernatant. כדי להסיר אריתרוציטים מן השעיית התא, resuspend ולדגור את גלולה התא עם 2 מיליליטר של מאגר תמוגת תאי הדם האדומים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להפסיק את התגובה על ידי הוספת חמישה עד 10 מיליליטר של RPMI מלא, ואחריו צנטריפוגה כפי שתואר קודם לכן.
לאחר שימוש חוזר בגלולה התא ב- RPMI מלא, ספר את התאים מכל עכבר והנח את המשולשים של 200, 000 טחול עם 200 מיקרוליטרים של cRPMI לתוך כל באר של צלחת 96 באר עם תחתית בצורת U. לאחר מכן, לדגור על הצלחות במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לטפל בתרבית התא עם 5 ננוגרם למיליליטר ברפלדין A, 20 ננוגרם למיליליטר PMA, ו 1 מיקרוגרם למיליליטר Ionomycin ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
לאחר הדגירה, להעביר את הטחול לצלחת 96-well עם תחתית בצורת V ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. לשפץ את הטחול כדורי בתמיסת כתמים טרי מוכן לדגור על השעיית התא במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. לקיבעון וחדירות, לשטוף את הטחול פעמיים במאגר FACS ולאחר מכן resuspend הטחול ב 100 microliters לכל באר של קיבעון ופתרון חדירות, ואחריו דגירה בחושך כפי שהוסבר קודם לכן.
להכתמת גמא האינטרפרון התאי, לשטוף את הטחול במאגר הקיבעון או permeabilization לפני שליחה חוזרת של התאים עם נוגדנים פלואורסצנטיים נגד אינטרפרון גמא מדולל 1:200 במאגר. לדגור על הטחול במשך 1 עד 12 שעות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר כביסה יסודית וחידוש ב- FACS-buffer, לנתח את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים על פי אסטרטגיית gating המוסברת בכתב היד.
בתמונה הייצוגית, מוצגת אסטרטגיית ההצטברות לניתוח ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים. התאים היו מגודרים כתאים בודדים, תת-קבוצה לימפוציטים, תאי T CD3-חיוביים קיימא, ותאי T ציטוטוקסיים CD8-חיובי CD8 שלילי CD4. הצטברות תאית של גמא אינטרפרון הוערך כסמן חלופי להפעלה.
לאחר החיסון עם רכבים חשמליים הנגזרים מתאי הגידול, נחקר האינדוקציה של תגובות תאי T ספציפיים לאנטיגן בעכברים המטופלים. הרכבים החשמליים שמקורם בגידול מתורבתים בתנאי לחץ גנוטוקסיים, כגון טיפול באוקסליפלטין, גרמו להפעלה חזקה של תאי T ציטוטוקסיים הטחול בניגוד לרכבים חשמליים לא מטופלים. קבוצת בעלי החיים שטופלו ברכב הראתה את התגובה הנמוכה ביותר.
ההפעלה של תאי T טחול נקבעה לאחר reimulation ex vivo או בנוכחות או היעדר אובלבומין. הייצור של גמא אינטרפרון הוגדל כאשר הטחול של בעלי חיים שטופלו בגידול EV הוחזרו עם מודל גידול אנטיגן סגלגל לפני הניתוח. שים לב כי תוצאות לשחזור מסתמכות על יעילות הבידוד המתמיד של כלי רכב חשמליים.
לכן, ודא כי כדורי EV הם resuspended לחלוטין ומיד כדי למנוע ייבוש. עם פרוטוקול זה, הצלחנו לנתח מסלולים ספציפיים בתוך תאים סרטניים הקובעים את האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול. זה עשוי לסלול את הדרך לרתום רכבים חשמליים אימונוגניים כאלה בטיפול בסרטן.
