טכניקה חדשה זו משלבת ספקטרומטריית ניידות יונים עם מודלים מולקולריים ותאוריית דינמיקת תגובות כדי לקבוע את התרמוכימיה היחסית של שתי תגובות דיסוציאציה מתחרות של קומפלקס טרנרי. השילוב של טכניקות אלה מאפיין את מסלולי התגובה של המגיבים והמוצרים, את המבנים הקונפורמיים ואת זיקתו של הליגנד ליצירת קומפלקס טרנרי עם יון המתכת. מחקר זה מדגים את התגובה של שני תגי פפטיד פוטנציאליים לטיהור חלבונים רקומביננטיים, כאשר התג מגיב עם המתכת הכלאט על ידי חומצה ניטרילוטריאצטית בעמודת זיקה מתכתית משותקת.
התחל על ידי טעינת דגימת 2 מיליליטר לתוך מזרק אף קהה של 2.5 מיליליטר והזרקת הדגימה לתוך האלקטרוספריי של המכשיר באמצעות משאבת המזרק של המכשיר בקצב זרימה של 10 מיקרוליטר לדקה. מקם את המכשיר בספקטרומטריית ניידות יונים שלילית, או במצב IM-MS. זהה את תבנית האיזוטופים של המסה למטען של קומפלקס קשירה טרנרי של מתכת חלופית טעונה שלילית, או קומפלקס אמב-מתכת-NTA, על-ידי פתיחת תוכנית ספקטרומטריית המסה ובחירה בספקטרום.
לאחר מכן, בחר כלים ואחריהם מודל איזוטופ. בחלון הקופץ, רשום את הנוסחה המולקולרית של המרכובת, סמן את התיבה עבור הצג יון טעון, הזן 1 עבור המטען של אחד שלילי, ולחץ על OK.In תבנית האיזוטופים המוצגת של המתחם, שים לב לשיא המסה הנמוך ביותר. בתוכנת המכשיר, בחר הגדרה ואחריה פרופיל מרובע.
לאחר מכן, בחר ידני קבוע והזן את המסה של שיא התבנית האיזוטופית הנמוכה ביותר. לחץ על עדכן וסגור את החלון. שוב, בחר הגדרה ולאחר מכן לחץ על פתרון מרובע.
אסוף את ספקטרום ה-IM-MS של היון השלילי החל מאנרגיית התנגשות ההעברה הראשונה באמצעות משך ריצה של 5 דקות וזמן סריקה של 2 שניות. חזור על הפעולה כדי לאסוף את ספקטרום ה-IM-MS עבור כל אחת מאנרגיות ההתנגשות האחרות. השתמש בהתפלגויות זמן ההגעה המשולבות, או אזורי ATD, עבור קומפלקס אמב-מתכת-NTA ושני מוצרים, קומפלקס מתכת NTA וקומפלקס אמב-מתכת, כדי לנרמל לסולם אחוזים יחסי.
מתוך סף השכפול של דיסוציאציה הנגרמת על-ידי התנגשות, או מדידות TCID, מצא את הממוצע ואת סטיות התקן של כל נקודת נתונים. לאחר מכן, המירו את אנרגיית ההתנגשות של העברת מסגרת המעבדה לאנרגיית ההתנגשות במרכז המסה. כדי למדוד חתכי התנגשות, אסוף את ספקטרום היונים השליליים IM-MS של 10 ppm poly-DL-alanine, או דגימת PA, למשך 10 דקות באמצעות תנאי ההפעלה האינסטרומנטליים.
לאחר מכן, אסוף את ספקטרום IM-MS של כל קומפלקס ternary במשך 5 דקות. חלץ את ה- ATD של כל אחד ממתחמי הרשות הפלסטינית והטרינריים וייצא את הקבצים שלהם לתוכנת ספקטרומטריית המסה באמצעות האפשרות שמור על זמן סחף. מצא את זמני ההגעה הממוצעים מהמקסימום של עקומות ה- ATD המתאימות.
השתמש בשיטת כיול חתך כדי להמיר את זמני ההגעה הממוצעים לחתכי התנגשות של המתחם הטרנרי. מהתפריט הראשי של CRUNCH, פתח את קובץ הטקסט GB5 המכיל את האנרגיה של מרכז המסה, או העוצמות היחסיות התלויות ECM של המוצרים. השב לא לקריאת פרמטרים.
לאחר מכן, בחר מידול ואחריו הגדר את כל הפרמטרים. מתוך אפשרויות מודל התגובה, בחר באפשרות ברירת המחדל של סף CID ואחריה RRKM עם אינטגרציה על התפלגות העברת האנרגיה של המתחם הטרנרי. הזן 2 עבור ערוצי מוצרים עצמאיים עם דגם, ובחר חשב חתכים.
עבור סוג המודל הלא מפותל, בחר חתך קלווין 0, הכולל את תיקון RRKM הסטטיסטי של התזוזות הקינטיות עקב חלון הזמן של 50 מיקרו-שניות מתא ההתנגשות לגלאי זמן הטיסה. עבור אפשרויות הקונבולוציה, בחר את האינטגרל הכפול של טירנן, הכולל את הקונבולוציה על פני התפלגויות אנרגיה תרגומיות בין יון הקומפלקס הטרנרי לבין גז התנגשות הארגון. לשיטת האינטגרציה הנומרית, בחר ריבוע גאוס עם חתכים שנשמרו מראש.
מהאפשרויות להזנת הפרמטרים המולקולריים, הזן G כדי לקרוא את קובץ המידול המבני עם תדרי הרטט והסיבוב PM6 של הקומפלקס הטרנרי. תשובה כן לשאלה:האם אחד המגיבים אטומי? כתוב את המיקום והשם של קובץ המידול.
הזן 1 עבור המטען על יון ו-1.664 עבור הקיטוב של גז הארגון. מסת היון ומסת המטרה הן עבור הקומפלקס הטרנרי והארגון, בהתאמה, והן נקראות באופן אוטומטי מקובץ הטקסט GB5. הזן 0 לקבלת רטט הרמוני.
לחץ על Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקובץ המידול המבני. בחר ערכי ברירת מחדל של 0 עבור טיפולי הרוטור המעוכב ו- 1 עבור סימטריית המולקולות. בחר את ברירת המחדל של 300 קלווין לטמפרטורת התגובה.
בחר אינטגרציה עבור השיטה להפחתת צפיפות מערך המצבים. בחר כן כדי לחתוך את חלוקת האנרגיה. הזן מספר גל 40000 לקבלת אנרגיה מרבית לחלוקה, 2 מספר גל עבור גודל סל ו- 32 עבור מספר הנקודות בחלוקת אנרגיה.
עבור פרמטרים עבור דגם TCID/RRKM, בחר כן לשינוי, הזן 0 עבור זמן קבוע ו- 0.000050 שניות עבור הגבול העליון של חלון הזיהוי. עבור ערוץ מוצר 1, בחר 1 עבור מצב מעבר יחיד מאפשרויות ערוץ הדיסוציאציה ו- 0 עבור אף אחד מהדיסוציאציה הרציפה. עבור סוג מצב המעבר, בחר 1 למסלול.
בחר G כדי לקרוא את קבצי תוכנית המידול המכילים את הפרמטרים הסיבוביים והרטטיים של PM6 עבור קומפלקס המתכת האמבית בתוספת מוצרי NTA. הזן לא עבור:האם אחד ממצבי המעבר של מרחב הפאזה, או PSL TS, הוא אטום מינים? הזן את המיקום והשם של קובץ קומפלקס האמב-מתכת.
השתמש ב- 1.062 עבור תדרי קנה מידה, לחץ על Enter עבור מספר האטומים, והזן לא עבור:האם המולקולה ליניארית? חזור על אותו הדבר עבור קובץ המידול המכיל את תדרי הרטט והתדרים הסיבוביים של מוצר NTA. הזן את התיאור של TS המקיף. הזן 1.0 לטעינה של יון מתכת אמב, ולאחר מכן הזן את הקוטביות ואת מומנט הדיפול של NTA.
בחר 0 קלווין לטמפרטורת סיבוב ודיפול נעול לטיפול במצב המעבר המקיף. הזן את המסות הממוצעות של יון המתכת האמב ו- NTA. מכה Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקבצי המידול.
בחר 0 עבור רוטורים מעוכבים, 1 עבור סימטריה של מולקולות ו- 1 עבור ניוון תגובה. הזן את האפשרות ללא שינויים. עבור ערוץ מוצר 2, בחר 1 עבור מצב מעבר יחיד, 0 עבור ללא עבור הדיסוציאציה הרציפה ו- 1 עבור מסלול עבור סוג מצב המעבר.
בחר G לקריאה בקובצי מידול המכילים את הפרמטרים הסיבוביים והרטטיים PM6 עבור קומפלקס NTA-metal ומוצרי AMB. לאחר מכן, הזן את התיאור של TS המקיף. הזן 1.0 לטעינה של יון קומפלקס מתכת NTA, והזן את הקוטביות ואת מומנט הדיפול של ה- amb. בחר 0 קלווין עבור טמפרטורת הסיבוב ודיפול נעול לטיפול במצב המעבר המקיף.
הזן את המסות הממוצעות של קומפלקס מתכת NTA ומוצרי אמב. מכה Enter כדי לקרוא את קבועי הסיבוב 1-D ו- 2-D מקבצי המידול. בחר 0 עבור רוטורים מעוכבים, 1 עבור סימטריה של מולקולות ו- 1 עבור ניוון תגובה.
לאחר מכן, הזן ללא שינויים. כדי לטפל בסיבובים דו-ממדיים לא פעילים, בחר באפשרויות ברירת המחדל להתפלגות תנע זוויתית סטטיסטית ושלב התפלגות P-E, G מעל J. השתמש בערך ברירת המחדל של 32 במספר הנקודות באינטגרציה.
בתפריט 'מודל', בחרו 'מטב פרמטרים להתאמת נתונים', והזינו את האנרגיה המינימלית והאנרגיה המרבית כדי להתחיל ולסיים את התאמת הנתונים, בהתאמה. בחר 1 עבור סטיות התקן הניסיוניות של מודלי השקלול. בהתבסס על הנתונים, בחר סטיית תקן מינימלית קבילה של בדרך כלל 0.01 עד 0.001.
השתמש בערך ברירת המחדל עבור מגבלת ההתכנסות E0 ובחר לא כדי להחזיק פרמטר כלשהו בערך הנוכחי, 0.5 ו- 2.0 electronvolt עבור הגבולות התחתונים והעליונים ו- 2 עבור שיטת ההערכה הנגזרת. בתפריט 'מיטוב', בחרו 'התחל מיטוב'. תוכנית CRUNCH תבצע אופטימיזציה של מודל TCID שנבחר לנתוני הניסוי.
לבסוף, בתפריט מודל, בחר delta-H ו- S ב- T להערכה התרמוכימית של שני ערוצי הדיסוציאציה. התמונה המייצגת מציגה את המבנים העיקריים של פפטידים חלופיים לקשירת מתכת A ו- H. הצבע מדגיש את אתרי קשירת המתכת הפוטנציאליים.
התלות האנרגטית ביצירת יוני המוצר אמב-מטאל ו-NTA-מתכת מוצגת כאן. אנרגיית ההתנגשות במרכז המסה, שבה יש 50% דיסוציאציה של קומפלקס ה-amb-metal-NTA, נכללת בגרפים. התמונות המייצגות מציגות את מודל הדינמיקה עבור שיטת TCID הנפתרת באנרגיה.
ההתנגשויות בין קומפלקס אמבה-אבץ-NTA בתוספת ארגון גורמות לדיסוציאציה לקומפלקס אמבה-אבץ ו-NTA חופשי, או קומפלקס NTA-אבץ ותוצרי אמב"ה חופשיים. אנרגיות הסף E1 ו-E2 שוות ערך ל-0 אנתלפיות קלווין של דיסוציאציה לתגובות קומפלקס אמבה-אבץ-NTA לקומפלקס אמבה-אבץ ו-NTA חופשי, או קומפלקס אמבה-אבץ-NTA לקומפלקס NTA-אבץ ו-ambH חופשי, בהתאמה. קומפלקסים של אמב-מתכת-NTA המותאמים לגיאומטריה של PM6 של A ו-H מוצגים כאן.
קונפורמרים אלה שימשו במידול TCID של נתוני הניסוי ונבחרו מתוך מבנים מועמדים אחרים על ידי השוואת האנרגיות האלקטרוניות של PM6 שלהם וכיצד חתכי ההתנגשות המחושבים שלהם בהשוואה לחתכי ההתנגשות של IM-MS נמדדו. ה-TCID שנפתר אנרגטית של ארבעת קומפלקסי ה-amb-metal-NTA מתואר בתמונות אלה. עבור מינים A ו-H, יוני המוצר של אמב-מטאל ו-NTA-מתכת עם התאמות סף CRUNCH מפותלות מוצגים כאן.
ערכי האנרגיה הם האנתלפיות של דיסוציאציה ב-0 קלווין עבור התגובות amb-metal-NTA ל-amb-metal ו-NTA חופשי, או amb-metaL-NTA ל-NTA-metal ו-amb חופשי. כאן מוצגת השוואה של האנרגיות החופשיות של גיבס של אסוציאציה בקילוג'ולים לכל שומה וקבועי היווצרות הנגזרים מהאנתלפיות של דיסוציאציה, נטו אפס קלווין, עם חישובי מכניקה סטטית באמצעות הפרמטרים PM6. התגובה של NTA-ניקל ו-ambA חופשי ליצירת קומפלקס ambA-ניקל-NTA מציגה את קבוע ההיווצרות הגבוה ביותר ומייצגת את התגובה שבה החלבון המתויג ב-ambA משותק על-ידי ה-NTA-ניקל בתוך עמודת הזיקה.
התאמת CRUNCH דורשת סינון קפדני של מגיבים ומוצרים כדי לקבל אנרגיות סף מדויקות. נדרשת מומחיות במידול מולקולרי להשגת המבנים והפרמטרים המולקולריים המהימנים. ניתן לפתח את השיטות הכוללות המתוארות כאן לסינון היעילות של מולקולות שנועדו לקשור קו-פקטורים מתכתיים ואתרים פעילים של חלבונים כדי לחסום את הפונקציות האנזימטיות.
