ספקטרומטריית מסה ניידות יון, או IM-MS, לזהות את היונים מוצרים שונים מן התגובה תלויי pH redox ו מחייב מתיל של פפטידים. עם המודל המולקולרי של המבנה שליו שלהם, מתאם מתכת ניתן לקבוע. IM-MS יכול לפתור כל אחד מיוני המוצר ולזהות את ההרכב המולקולרי שלהם על ידי מדידת זמני המסה לטעינה וההגעה שלהם ולהתייחסות לסטואיכומטריה, מצב הפרוטונציה והמבנה הקונפורמי שלהם.
פיתוח סוגים של פפטידים כלאט מתכת יעזור להוביל טיפולית למחלות הקשורות חוסר איזון יון מתכת, כגון מנקס ומחלת וילסון, סרטן, ומחלת אלצהיימר. כדי להתחיל, לנקות את צינורות הכניסה ESI נימי מחט ביסודיות עם כ 500 microliters של 0.1 חומצה אצטית קרחונית טוחה, 0.1 אמוניום הידרוקסיד טוחן, ולבסוף, מים deionized. השתמש בתנאי ESI-IM-MS מקוריים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף את ספקטרום IM-MS יון שלילי וחיובי של פתרון פולי-DL-אלנין 10 עמודים לדקה למשך 10 דקות כל אחד.
פיפטה 200.0 microliters של 0.125 מילימולר חלופה מתנובקטין, או פתרון אמב, לתוך בקבוקון 1.7 מיליליטר. מדללים עם 500 מיקרוליטרים של מים deionized ומערבבים את הפתרון ביסודיות. התאם את ה- pH של המדגם ל- 3.0 על-ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של תוסף חומצה אצטית טוחנת 1.0.
הוסף 200.0 מיקרוליטר של יון מתכת 0.125 מילימולר לדגימה המותאמת ל- pH. לאחר מכן, להוסיף מים deionized להניב נפח סופי של 1.00 מיליליטר של המדגם. מערבבים היטב, ומאפשרים לדגימה לצייד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
באמצעות מזרק אף קהה, לקחת 500 microliters של המדגם ולאסוף את הספקטרום יון שלילי וחיובי ESI-IM-MS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש ב-500 המיקרוליטרים הנותרים של המדגם כדי לתעד את ה- pH הסופי שלו באמצעות אלקטרודה מכוילת של מיקרו-pH. חזור על שלבים אלה, למעט כדי להתאים את ה- pH ל- pH ארבע, חמש, שש, שבע, שמונה, תשע או 10, על-ידי הוספת כמויות חדשות של חומצה אצטית או פתרונות אמוניום הידרוקסיד.
אסוף את הספקטרום השלילי והחיובי ESI-IM-MS של הפתרונות המתקבלים למשך 10 דקות כל אחד. מתוך ספקטרום IM-MS, לזהות אילו מינים טעונים של מתנובטין חלופי נמצאים על ידי התאמתם לדפוסי האיזוטופ המסה לטעינה התיאורטיים שלהם. לשם כך, פתח את MassLynx ולחץ על כרומטוגרמה כדי לפתוח את חלון הכרומטוגרמה.
עבור לתפריט קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. חלץ את ספקטרום הודעות מיידיות-MS על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, גרירה לאורך הכרומטוגרמה ושחרור. חלון הספקטרום ייפתח, המציג את ספקטרום IM-MS.
בחלון הספקטרום, לחץ על כלים ומודל איזוטופ. בחלון הדוגמנות של איזוטופ, הזן את הנוסחה המולקולרית של זן ה- amb, בדוק את התיבה הצג היונים טעונים והזן את מצב המטען. לחץ על אישור. חזור על תהליך זה כדי לזהות את כל המינים בספקטרום IM-MS, ולתקליט את טווח האיזוטופים שלהם מסה לטעינה.
עבור כל מין אמב, הפרד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה וחלץ את הפצות זמן ההגעה שלהם, או ATDs, באמצעות דפוסי האיזוטופים ההמוניים שלהם כדי לזהות אותם. פתח את DriftScope ולחץ על קובץ ופתח כדי לאתר ולפתוח את קובץ הנתונים IM-MS. השתמש בעכבר ולחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי להגדיל את תבנית האיזוטופים ההמונית-לטעינה של זן ה- amb.
השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את תבנית האיזוטופ. לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי להפריד בין כל מינים מקריים של מסה לטעינה, השתמש בכלי הבחירה ובלחצן העכבר השמאלי כדי לבחור את זמן ATD המיושר עם תבנית האיזוטופ של זן ה- amb.
לחץ על לחצן קבל את הבחירה הנוכחית. כדי לייצא את ATD, עבור אל קובץ, יצא ל- MassLynx. לאחר מכן בחרו 'שמור על זמן דריפט' ושמור את הקובץ בתיקיה המתאימה.
בחלון הכרומטוגרמה של MassLynx, פתח את הקובץ המיוצא שנשמר. לחץ על תהליך, שלב מהתפריט, בדוק את התיבה שילוב שיא של ApexTrack ולחץ על אישור. רשום את המרכז ואת האזור המשולב של ATD. לאחר חזרה על תהליך זה עבור כל קבצי הנתונים Amb ו- poly-DL-alanine IM-MS שנשמרו, השתמש ב- ATD המשולב עבור כל מיני ה- Amb שחולצו של היונים החיוביים או השליליים בכל נקודת טיגרציה כדי לנרמל לקנה מידה יחסי של אחוזים.
לשם כך, הזן את זהותם של המינים amb ואת ATD המשולב שלהם בכל pH לתוך גיליון אלקטרוני. עבור כל pH, השתמש בסכום ה- ATDs המשולבים כדי לנרמל את ה- ATD של המינים הבודדים לקנה מידה של אחוזים. התווה את אחוזי ההתעצמות של כל מין אמב לעומת pH כדי להראות כיצד האוכלוסייה של כל מין משתנה כפונקציה של pH.
באמצעות גיליון אלקטרוני, המר את חתך ההתנגשות של היונים השליליים והחיוביים של פולי-DL-אלנין הנמדדים בגז חיץ הליום לצלב ההתנגשות מתוקן. לאחר מכן, להמיר את זמני ההגעה הממוצעים של מכיילים פולי-DL-אלנין ו amb מינים לתוך זמני סחף. חבר את זמני ההיסחפות של מכוולי הפולי-DL-אלנין לעומת חתך ההתנגשות שלהם.
לאחר מכן, באמצעות התאמה של רגרסיה בריבועים לפחות, קבע את הערכים A prime ו- B, כאשר A prime הוא התיקון עבור פרמטרי הטמפרטורה, הלחץ והחשמל שדה, ו- B מפצה על ההשפעה הלא ליניארית של התקן ההודעות המיידיות. באמצעות ערכים אלה A prime ו- B עם ערך זמני סחף centroid, לקבוע חתך התנגשות מתוקן שלהם ואת חתך ההתנגשות שלהם. שיטה זו מספקת חתך התנגשות עבור מיני פפטיד עם שגיאות מוחלטות משוער של כ 2%באמצעות גאוסיאן עם GaussView, ואת B3LYP LanL2DZ רמת התיאוריה, לאתר קונפורמרים אופטימיזציה גיאומטריה עבור כל סוגי התיאום האפשריים של מינים amb מסה לטעינה שנצפו.
רמת התיאוריה B3LYP LanL2DZ מורכבת מהפונקציונליות ההיברידית ההיקפית של בק שלוש, סט הבסיס של דאנינג ופוטנציאל ליבת האלקטרונים. לחלץ את הניתוחים תרמוכימיים של כל אחד קונפורמים אופטימיזציה מקובץ פלט Gaussian ולחשב חתך ההתנגשות התיאורטית שלהם באמצעות שיטת Lennard-Jones בקנה מידה יון מתוכנית סיגמא. מתוך קונפורמי האנרגיה החופשית הנמוכים ביותר, קבע איזה קונפורמר מציג את חתך רוחב ההתנגשות לנארד-ג'ונס שמסכים עם חתך ההתנגשות הנמדד IM-MS.
תהליך זה מזהה את המבנה שליו ואת סוג הקואורדינציה עבור הקונפורמים שנצפו בניסוי. מידול מולקולרי דורש השוואה של האנרגיה החופשית וחתכים התנגשות של קונפורמרים עם אתרי כלאט מתכת שונים, קשרים cis וטרנס פפטיד, גשרי מלח, מימן מליטה, ואינטראקציות pi-cation. מחקר IM-MS של מתנובטין חלופי אחד הראה כי הוא chelated הן נחושת ואבץ ions באופן תלוי pH, אבל באמצעות מנגנוני תגובה שונים ואתרי תיאום.
כריכת אבץ (II) נצפתה ב- pH של יותר משש, בעיקר יצירת קומפלקס טעון שלילי אחד, המציין אבץ (II) היה tetrahedrally מתואם על ידי שני imidazoles ושני thiolates. כריכת נחושת (II) לוותה על ידי thiols להרכיב גשר disulfide. ב- pH של יותר משישה, קומפלקס נחושת טעון שלילי יחיד (II) נוצר, המציין imidazole ושני חנקן בין deprotonated היו תיאום נחושת(II)עם זאת, מתחת pH שש, הוספת נחושת(II) גם יצרה את קומפלקס נחושת טעון חיובי יחיד(I),כמו גם יחיד טעון חיובי נחושת (II) קומפלקס מעל pH שש.
מחקרים IM-MS של amb 2 ו amb ארבעה גם מראים כי תגובות נחושת נתן מוצרים שונים במספרים של גשרים דיסולפידים inter-או intramolecular, מספר נחושת(I)או נחושת(II)ions, ומספר אתרי deprotonation, אשר השתנה כפונקציה של pH. התוצאה IM-MS עם מידול מולקולרי הראה כי מתנובוקטין חלופי יכול לתאם עד שלושה נחושת (I) ions באמצעות thiolate, imidazoles, וקבוצות קרבוקסילאט. יש לבחור בקפידה את ההגדרות האינסטרומנטליות של IM-MS כדי לשמר את הסטויצ'יומטריה של הפפטידים, את הפצות ההאשמות ואת המבנים הקונפורמיים, כמתואר בטקסט.
שילוב של טווח רחב יותר של גודל שישפיע על תיאום מתכת כגון טירוזין בחומצה אספרטית יאפשר הבנה טובה יותר של הקשר בין מבנה לתפקוד. IM-MS עם מודלים מולקולריים הפכו לטכניקות חלופיות להאצת קריסטלוגרפיה וספקטרוסקופיה של NMR לקביעת המבנים הקונפורמיים של חלבונים, DNA, שומנים, ואת המתחמים שלהם.
