מימון עבור עבודה זו ניתן על ידי ביטוח בריאות הממלכתית ומועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (NHMRC פרויקט מענק 1011352 לMEC וMJC; תכנית מחקר עצמאית מכוני תשתיות תמיכה [IRIISS] מענק לWEHI) והממשלה ויקטוריאני (VESKI חדשנות המלגה לMEC; תמיכת מדינה ויקטוריאני ממשלה תפעולית תשתיות לWEHI). MEC הוא עמית אליזבת שנייה מלכת המועצה למחקר האוסטרלי. EFXB מודה תמיכה מתכנית נורמה ילדת שוסטר המלגות באוניברסיטת מלבורן.

1. שיבוט ועיצוב Construct לשכפל את הרצפים של עניין לוקטור PMM-פפטיד (אשר יכול להיות מסופק על פי בקשה) בשימוש באתרי הגבלת BamHI (ראה תרשים 1) HindIII ו. להוסיף גדילי הדנ&quot;א כפול צריך לשלב, לפי הסדר הבא: אתר HindIII; קודון מתיונין אחת למחשוף CNBr; E. פפטיד coli קודון המותאם לקידוד רצף; קודון עצירה; אתר BamHI. כל methionines האחר בפפטיד צריך לחסל ורצף dipeptide ASP-Pro יש להימנע ככל שזה יהיה גם הבקיע בתנאים חומציים. שאריות ציסטאין ייחודיות צריכות להיות הציגה לכל רצף פפטיד פי המיצוב הרצוי של crosslink דיסולפיד במתחם סופי, וכל cysteines האחר יש מוטציה לסרין. פלסמיד נושא קלטת התנגדות kanamycin לבחירה. 2. ביטוי של trpLE-peptiפיוז&#39;ן דה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור ובינוני סטרילי מסנן M9/Kan מינימאלי צמיחה (0.1 המ&quot;מ CaCl 2, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 3 ג&#39;/ ליטר KH 2 PO 4, 7.5 גר &#39;/ ל&#39; Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 גר &#39;/ L NaCl, 1 גרם / L NH 4 Cl, 4 גרם גלוקוז / L, סולפט 50 מ&quot;ג / ליטר kanamycin). תוספת עם Centrum מלא לאבץ כדי לספק B-ויטמינים ומתכות קורט: לפזר 1 טבלית ב40 המ&quot;ל H 2 O עם הערבוב למשך 30 דקות, צנטריפוגות כדי להסיר חומר מסיס וסטרילי סינון supernatant הכתום. פתרון חנות מנייה ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות ולהשתמש 4 מ&quot;ל / ליטר בM9. הערה: 15 4 Cl N-מועשר NH, 13 גלוקוז C-מועשר או מבשרים אחרים יציב, איזוטופ שכותרת-עשוי להיכלל במדיום M9 בשלב זה אם רוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות המתנע 100 מ&quot;ל מהפך טרי BL21 (DE3) המתח E. חיידק במדיום M9/Kan. לגדול בין לילה על 37 מעלות צלזיוס עם הרעד ב 200 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, בדוק את OD 600 של תרבות המתנע - זה צריך להיות בטווח של 2 או יותר. דלל את תרבות 100 מיליליטר המתנע לנפח כולל של 1 הליטר Centrum-M9 תוספת בינונית. התפצל לשתי 2 צלוחיות מבולבלות L (500 מיליליטר תרבות בכל בקבוק) ולגדול ב 37 ° C רועד ב 140 סל&quot;ד עד 600 OD מגיע 0.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה ייקרה עד 18 מעלות צלזיוס ולהמשיך רועדים לשעה 1, המאפשר תרבויות להתקרר לחלוטין לפני הגיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לדוגמה טרם גיוס לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1), לאחר מכן להוסיף IPTG לריכוז סופי 0.1 מ&quot;מ כדי לגרום ביטוי של היתוך trpLE-פפטיד. להמשיך ולצמוח ב18 ° C/140 סל&quot;ד הלילה (16-20 שעות) תחת אינדוקצית IPTG. </li></ol> 3. הכנת גוף הכללה ועקידת מטריקס ניקל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> OD 600 של תרבויות ביטוי הלילה במדיום מינימאלי הסופי הוא משתנה וshould להיות בין 2.5 ל 5.0. קח דוגמה לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך של 50 μl מתרבות בOD 600 = 1) ולאסוף תאים על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב5000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלול מתרבות 1 ליטר בחיץ תמוגה מ&quot;ל 50 (50 mM טריס-HCl pH 7.5, 20 מ&quot;מ β-ME, 0.2 מ &#39;NaCl). מתלי תא ניתן לאחסן קפוא לעיבוד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים על ידי sonication על קרח בתפוקה מקסימלית לדקות 1 ומנוחה על קרח למשך 5 דקות. אנו משתמשים Sonicator Misonix 3000 (600 ואט פלט לכל היותר) עם קצה בעצמה גבוהה להחלפת ½ אינץ&#39;. חזור sonication / קירור לשלושה מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הכללת גוף חומרי לא מסיסה (IB) על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב20000 XG ולהשליך supernatant. שכבה רופפת, דקה של פסולת תא בצבע בהיר יכולה להיות גלויה בחלק העליון של IB הגלולה הצפופה, זה יכול להיות נשטף באמצעות מים או חיץ עם תסיסה עדינה. ניתן לחזור על שלבים 3.3 ו 3.4 כדי לשפר את הטוהר של שבריר IB אם desiאדום. דוגמאות של גלולה וחומר supernatant צריכות לקחת לניתוח SDS-PAGE כדי לאשר לוקליזציה היתוך trpLE-TM לגופי הכללה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס IB כדורים בguanidine פתרון (6 M guanidine HCl, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 מ&quot;מ β-ME), תוך שימוש ב25-50 מ&quot;ל לליטר של תרבות מעובד. צעד זה יחייב כמה שעות עם תסיסה וsonication קל מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה IB lysate ידי צנטריפוגה לשעה 1 ב75,000-100,000 XG ו20 ° C. למזוג supernatant וסינון דרך קרום מיקרומטר 0.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב פינה IB lysate, בצינור 50 מיליליטר חרוטים או כלי גדול שיכול להיות סגור היטב, עם שרף זיקת ניקל שנשטף במים ומתאזנים לפתרון guanidine. השתמש שרף התיישב מ&quot;ל 3-4 לליטר של תרבות מעובדים לfusions שמבטא במידה דומה כמו trpLE-DAP12TM מוצג כאן (איור 3, בסמטה 2). לאגד תצווה על ידי דוגר בלילה בחדר לא<html> emperature עם ערבוב עדין. </li></ol> 4. Crosslinking חמצונים בטור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען השעית lysate / ניקל IB השרף לעמודת זרימה הכבידה ריקה עם תמיכת מיטה נקבובית, והוסיף ברציפות עד שכל הנפח זורם דרכו. לאסוף ולשים בצד flowthrough, שעדיין עשויה להכיל חלבון היתוך לא מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שרף ניקל ידי זרימה הכבידה עם 5 כרכי המיטה של ​​תמיסת אוריאה (8 אוריאת M, 50 mM טריס-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl) המכילים 5 מ&quot;מ β-ME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שרף ניקל שוב עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה בלי β-ME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את שרף ניקל פעם שלישית עם 5 כרכי מיטה של תמיסת אוריאה שכבר השלימו עם 20 מיקרומטר CuSO 4 ו2 מ&quot;מ החמצון גלוטתיון. לאחר שטיפה זו, סגור את שקע העמודה ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר היווצרות קשרי דיסולפיד מקסימלי. </li></ol> 5. Elution וquantitation TFA תוכן &quot;&gt; זהירות: חומצת Trifluoroacetic (TFA) גורמת לכוויות קשות במגע עם עור ואדים הם מעצבן ביותר TFA המרוכז יש להשתמש רק במנדף כימי אושר בהגנה על עין וכפפות ללא לטקס בדקו את התאימות הכימית מכולם.. חומרים בשימוש; פוליפרופילן תואם את כל השלבים של פרוטוקול זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פתרון אוריאת חמצון עם 10 כרכי מיטה של ​​מים ולייבש את מיטת העמודה על ידי יישום שורת ואקום לשקע עמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את שקע העמודה ולהוסיף 1.5 כרכים של מיטה המסודר (99-100%) TFA. מערבב את שרף ניקל עם מרית קטנה כדי להבטיח אפילו חשיפה לחומצה ודגירה במשך 5 דקות. פתח את שקע העמודה ולאסוף eluate החומצה, pressurizing עדינות עם מזרק או קו האוויר דחוס במידת צורך לדחוף את כל הנוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב elution חומצה עם 1.5 כרכים עוד מיטה של ​​TFA המסודר. לעבוד במהירות בשלב זה כדי להימנע מפירוק מלא של beadeד agarose מטריצה. תשואת חלבון ניתן לקבוע בשלב זה על פי משוואת באר למברט ומקדם ההכחדה הטוחנת התיאורטית של רצף trpLE-פפטיד. לדלל מדגם של eluate TFA (1:20-01:50) בtrifluoroethanol (TFE) ולמדוד את הספיגה ב 280 ננומטר, באמצעות TFA / TFE באותו הדילול כריק. </li></ol> 6. עיכול CNBr זהירות: ברומיד Cyanogen (CNBr) הוא רעיל ביותר ויש לטפל רק בברדס אשר כימי קטר. PPE כולל משקפי מגן, חלוק מעבדה וכפפות לטקס שאינם נדרשים באופן מוחלט. CNBr הוא תגובה ללחות ויש להביא לטמפרטורת חדר לפני הפתיחה. צור קשר עם משרד הביטחון המוסדי לקבלת הוראות לנטרול / סילוק של פתרונות CNBr מזוהמים וחומרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל את eluate החומצה לריכוז TFA סופי 80% על ידי בנוסף dropwise של מים תוך כדי הערבוב בעדינות. אם נוצר משקע,dd חזרה נפח קטן (0.5-1 מ&quot;ל) של TFA המסודר עד שהתמיסה מבהיר, אז מחדש נכונה עד 80% במים. קח 5 מדגם מראש לעכל μl לניתוח SDS-PAGE, הקפאה בחנקן נוזלי וlyophilizing המדגם באופן מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גבישי CNBr לכ -0.2 גר &#39;/ מ&quot;ל, מטפל לשקול כימי הרעילה בבטחה בצינורות סגורים, מראש שקלו או באמצעות איזון בתוך מנדף הכימי. מערבב בעדינות עד שהיא נמסה לחלוטין. לשטוף ולאטום את כלי תגובה בגז אינרטי (חנקן או ארגון זרם) ולדגור שעות 3-4 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5 מדגם הפוסט לעכל μl לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. להעביר את התגובה לקלטת לעכל תאית מחדש דיאליזה או צינורות (יצטט תאית יתמוסס בחומצה מרוכזת) עם הפסקת משקל מולקולרית של 3.5 kDa או פחות, בהתאם לגודלו של מתחם פפטיד הצפוי. דיאליזת הלילה עד 4 ליטר מים במנדף הכימי כדי להפחית את ריכוז TFA ולפרק כל CNBr unreacted. השאר מקום בקלטת הדיאליזה או צינורות לגידול משמעותי בנפח (כמו שתיים ושלושה של פי) במהלך דיאליזת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון תגובת הדיאליזה עם משקע הושעה מקלטת הדיאליזה או צינורות (רוב החלבון יזרזו כאשר ריכוז TFA מצטמצם) ולהעביר את ההשעיה עד 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל. הקפא וlyophilize להסיר מים ועקבות של CNBr / TFA. צעד זה עשוי לדרוש כמה ימים. זהירות: שניהם תגובה לעכל דיאליזה ודיאליזת המים צריכה להמשיך להתייחס אליהם כרעיל וטפל / נפטר עם אמצעי זהירות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות של תרבויות משלבים טרם גיוס וקציר, הכללת הגוף supernatant וגלול, eluate TFA וCNBr-מתעכל חומר עשויות להיות מנותחות על ידי SDS-PAGE. הכן את הדגימות על ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בInvitrogen NuPAGE LDS samplחיץ דואר. דגימות לעכל eluate וTFA צריך להיות מוכן בתנאי שני הקטנה ולא להפחתה לזיהוי ולהערכה של מוצר crosslinking חמצונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הדוגמות על 12% ג&#39;ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide באמצעות MES-SDS חיץ פועל לרזולוציה אופטימלית של המוצרים לעכל הקטנים ביותר. </li></ol> 7. טיהור של מכלולי פפטיד דיסולפיד-crosslinked HPLC התהפך שלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס עד 100 מ&quot;ג של מוצרים לעכל lyophilized לחומצה פורמית 2-3 מ&quot;ל מסודר ועומס על preparative קנה מידה (21.2 x 150 מ&quot;מ) Agilent ZORBAX SB-300 C3 עמודת PrepHT בממס (בדרך כלל אצטוניטריל 10-20% או 5 -10% Isopropanol במים עם 0.1% TFA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute את המוצרים לעכל בשיפוע של B ממס (אצטוניטריל או isopropanol עם 0.1% TFA) על לפחות 5 כרכי עמודות. ראה דיון להצעות על הבחירה של שיפוע תנאים אופטימליים לרצפים פפטידים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת50-100 דגימות μl מכל שבריר HPLC לניתוח SDS-PAGE ולהקפיא וlyophilize באופן מיידי. הסרת ממסי HPLC היא מהירה וצריכה להיות מלא ב1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות HPLC lyophilized לSDS-PAGE ידי חימום עד 95 מעלות צלזיוס בחיץ מדגם LDS NuPAGE Invitrogen ללא סוכן צמצום. מצננים ולפצל כל דגימה שווה ל 2 צינורות microcentrifuge, והוסיף DTT 100 מ&quot;מימ לאחד מהם וחימום מחדש לזמן קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את דגימות HPLC המופחתות ואינן מופחתות על 12% ג&#39;ל NuPAGE bis-טריס טרומי acrylamide עם MES-SDS ריצת חיץ כאמור לעיל. פפטידים קטנים, הידרופובי לעתים קרובות לא יתפסו Coomassie הכתם היטב ולא יכולים לרוץ במשקלים המולקולריים הצפויים שלהם. עם זאת, השוואה של דגימות מופחתות ואינן מופחתות צריכה להקל זיהוי של המוצרים וההערכה של טוהר פפטיד crosslinked. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את שברי מועמד פפטיד המכילים על ידי מטריקס בסיוע יינון desorption ליזר זמן של טיסה (MALDI TO-F) ספקטרומטריית מסה (ראה דיון) כדי לזהות את המין של עניין ולאשר המוניים הצפויה שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב, להקפיא וlyophilize שברי HPLC המכילים קומפלקס הטהור, crosslinked TM פפטיד ולקחת משקל יבש של המוצר הסופי כדי לקבוע את התשואה. שברים עם תוכן isopropanol גבוה לא יכולים להישאר קפואים. אם שברי פפטיד להתייבש עד לסרט ולא מוצר lyophilized אוורירי, מחדש להתמוסס לחלוטין בסרט נפח קטן של טהור hexafluoroisopropanol (HFIP), להקפיא וlyophilize שוב. מוצר HFIP טופל צריך להיות חרוט קטן, לבן, כי הוא הטה קלות החוצה ומשקליו. </li></ol>

<ol>
	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הביטוי של fusions trpLE-TM. מניסיוננו, fusions trpLE-TM מבוטא היטב במדיום התרבות עשיר על 37 מעלות צלזיוס, ובתנאים שתוארו כאן התרבות הוכיחו מוצלחים עבור רצפים שונים המכילים 1-4 תחומי TM עם תשואות הנעות 50-150 מ&quot;ג / ליטר של היתוך טהור, ללא פגע. קידוד fusions שלוש או ארבעה שברי TM GPCR (CCR5 האנושי TM1-TM3 וTM4-TM7, בהתאמה) או שבר קטליטי ליבה של peptidase פפטיד אות האנושית (ארבעה תחומי TM, ראה שופט 15) מייצג הנמוכים ביותר בטווח זה של ביטוי רמות, ואילו גרסות DAP12TM הקשורים קשר הדוק לרצף משמש כאן מייצג את הקצה העליון של הטווח (נתונים שלא פורסמו). ריכוז IPTG האופטימלי צריך להיקבע באופן ניסיוני עבור כל רצף חדש. התקן שלנו הוא 0.1 מ&quot;מ, וריכוזים גבוהים יותר (עד 1 מ&quot;מ) בדרך כלל תוצאה של תשואה בשל שתי רמות הביטוי הנמוכות באופן משמעותי וצפיפות תרבות נמוכהקציר לא (ראה לדוגמה באיור 1 א 7 הפניה). וריאציות על הפרוטוקול שהוצג. הפרוטוקול מפורט כאן מתארות את הייצור של דיסולפיד crosslinked-TM פפטיד מורכב, DAP12TM 8 homodimer. לחלופין, בפרוטוקול להתאים בקלות לייצר פפטידים monomeric ידי השמטת שני הצעדים שנועדו לשטוף להסיר צמצום הסוכן וחמצן את המוצרים המאוגדים (4.3 ו -4.4). אנחנו השתמשנו בעבר וריאציה אחרת של ההליך דיווחה כאן כדי לייצר מורכב התייצב קוולנטית TM פפטיד המייצג את DAP12-DAP12-NKG2C TM הרכבת trimeric (ראה התייחסות 8 ושיטות שתוארו בו). ביישום זה, 1-TM היתוך trpLE-DAP12 והיתוך 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C היו מעורבים בשלב קציר התרבות לפני הכנת גוף הכללה (צעד 3.1-3.2). ההליך כלל צעד HPLC נוסף לבודד את heterodimeric crosslinked trpLEמוצר היתוך מeluate החומצה (שלב 5.3) לפני CNBr לעכל. טיהור C3 של מוצרי פפטיד הביאה התאוששות של דימר דיסולפיד-crosslinked DAP12TM שבגדיל אחד נשא תחום TM NKG2C כבמסגרת היתוך C-מסוף. מבנה NMR הפתרון מורכב זה במיצלות דטרגנטים אשר כי תחום TM NKG2C התאסף עם DAP12 באורינטציה שלו הילידים, אנטי המקבילה 8. השלבים הנוספים בוריאציה זו באופן משמעותי את התשואה של התוצר הסופי: הכנה טיפוסית הניבה 8-10 מ&quot;ג של פפטיד &quot;trimer&quot; מ4L של היתוך 1 בשילוב עם עודף של 2. וריאציה זו מייצגת פרוטוקול התחלה טוב עבור חוקרים המבקשים לייצר מתחמי דיסולפיד-התייצב המכילים שני רצפי TM שונים. הערות על טיהור ניקל זיקה. Elution של חלבון מעמודת ניקל המיובשת באמצעות חומצה מרוכזת היא הליך חריג ולא מקובל מחדששימוש במטריצת ניקל. ניסיונות elute את fusions trpLE-TM מאוד הידרופובי באמצעות imidazole או EDTA הביאו להתאוששות לא מלאה של חלבון ואת מיני crosslinked מעדיפים נשמרו בעמודה (תוצאות לא פורסמו). הכמות המומלצת של מטריצת ניקל ופרוטוקול הלילה יצווה מחייב מוטבו בזהירות כדי להרוות את המטריצה ​​עם חלבון trpLE-TM ובכך למזער את שיתוף הטיהור של מזהמים. אנחנו באופן שגרתי להתאושש מוצרים מאוד טהורים עם תשואות שעולות משמעותי על יכולת הקשירה המפורסמת של סיגמא HIS-בחירת ניקל זיקת מטריקס (15-20 שרף מ&quot;ג / מ&quot;ל). Elution החומצה מבטל גם צעדי ביניים הנדרשים למעבר לCNBr העיכול, ותשואה המוגברת של מוצרי crosslinked יותר מקיזוז העלויות של מטריצת ניקל, במיוחד כאשר סימון בריאגנטים-איזוטופ היציב יקרים לתמ&quot;ג. תנאי ציאנוגן ברומיד לעכל. שחרורו שלפפטידים TM התמזגו מtrpLE בCNBr מבוצע בדרך כלל באמצעות 70% חומצה פורמית כממס משום שגם שיעור התגובה ומסיסות חלבון הם חיוביים ביותר בתנאים אלה. עם זאת, פעמי טיפול חייבות להיות כל זמן קצר יחסית (מתחת 1 שעה לעיכול), כדי למנוע esterification formyl של סרין ותראונין שאריות 16,17 ואולי אני-formylation של שאריות טריפטופן 18, שינויים שניתנים לאיתור על ידי ספקטרומטריית מסה כמינים שנצפה מסה הוא 28 Daltons (n) יחסית למסה הצפויה. העדפתנו לTFA כפי שמתואר כאן נמנעה מהשינויים הללו לחלוטין. מחשוף האנזימטית של היתוך trpLE-TM באמצעות הפקטור Xa פרוטאז ב1% טריטון X-100 כבר דיווח על 11, אך המסיסות הגרועה של רוב fusions trpLE-TM והסיבוך של חוסר נגישות אתר מחשוף במיצלות דטרגנטים כנראה להגביל את התועלת הכללית של זו גישה. טיהור pepti HPLC התהפך שלבמוצרי דה מCNBr לעכל הוא הצעד המאתגר ביותר בהליך זה, וסביר דורש אופטימיזציה עבור כל רצף חדש trpLE-TM. התצפיות הבאות מגיעות מעיבוד רצפים רבים ושונים והם עשויים להיות נכונים גם לגבי רוב fusions trpLE-TM: בחירת השלב נייח אנו מוצאים עמודות Agilent ZORBAX יציב בונד C3 (300 גודל נקבובי, 5 מיקרומטר גודל חלקיקים). להיות שלב מעולה נייח במונחים של הסלקטיביות, כוח לפתרון ויציבות תחת חשיפה כבדה לחומצה מרוכזת. חצי preparative (9.4 קוטר מ&quot;מ) וpreparative קנה מידה (21.2 מ&quot;מ קוטר) גדלים זמינים ובצעו היטב בידינו. C4, diphenyl ושלבים נייחים cyanopropyl עשוי גם לספק אלטרנטיבת פפטיד סלקטיביות שימושית במגוון hydrophobicity דומה בהשוואה ל-C3. הכנת מוצרים לעכל לHPLC. פירוק מוצרי lyophilized CNBr לעכל במסודר עבורמיקרופון חומצה מספקת את התוצאות הטובות ביותר עבור הפרדת HPLC. הכנה TFA או בממסים אורגניים כגון אצטוניטריל, trifluoroethanol וdimethylformamide לעתים קרובות תוצאות מסיסות נמוכה, הקטין עמודה מחייבת ו / או elution של מוצרים בפסגות רחבות המכילות מינים רבים. יש להקפיד להכין מוצרים בחומצה פורמית מייד לפני טעינת טור בגלל חשיפה ממושכת יכולה לגרום לשינוי של formyl sidechains פפטיד 16-18 כפי שנדונה לעיל. אופטימיזציה של elution השיפוע HPLC. אנחנו בדרך כלל מתחילות עם אצטוניטריל 10-20% או 5-10% isopropanol במים עם TFA 0.1% כfusions ממס א TrpLE-TM והמוצרים לעכלם מומסים בחומצה פורמית יחייב את עמודת C3 כב עד 40% אצטוניטריל כפי שמוצג כאן (איור 4). הרבה מבר trpLE המשוחרר יכול לזרום דרך בתנאים אלה (שימו לב שבר trpLE הוא המוצר היחיד בחלבון FTשבריר איור 5: 1, נתיב), ואנחנו מנצלים את ההבחנה הזאת כדי להגדיל את הקיבולת הכוללת של מחייבת העמודה למוצרים הרצויים. Acetonitrile וisopropanol יעילים מאוד כממסים הדרגתיים, ולעתים קרובות אנו מגיעים למצבי השיפוע הסופיים שלנו על ידי ערבוב פתרוני ממס קיימים מראש לשנות פרופילי elution, וכתוצאה ממתכונים לפעמים מוזרים אך יעילים כמו 75% isopropanol, Acetonitrile 25%, 0.1 פתרון TFA% משמש כB פתרון לטיהור DAP12TM שמוצגת כאן. מוצרים מאוד הידרופובי שהיו בעייתיים כבר eluted באמצעות אצטוניטריל או isopropanol עם תוספת של עד 10% trifluoroethanol (TFE) וריכוזים גבוהים של TFA (עד 0.3%) בשניהם A ו-B (תוצאות לא פורסמו). אחרים דיווחו על תוצאות טובות באמצעות שלבים ניידים חומצת butanol / אצטית עם שלב נייח C4 9. ניתוח של מוצרי עיכול. שניהם טכניקת הניתוח המרכזיתזה משמש כאן, SDS-PAGE וMALDI-TOF MS, יכולים להיות מסובך מאוד מהאופי הידרופובי של מוצרי trpLE-TM. דגימות אנליטיים Lyophilized מתגובות CNBr / TFA לעכל ופיצולי HPLC לפעמים לרוץ כמו אגרגטים משקל מולקולרי גבוה בג&#39;ל SDS-עמוד. אנו מוצאים כי טיפול של דגימות lyophilized עם נפח קטן של HFIP מחדש lyophilization לפני ההכנה לSDS-עמוד לעתים קרובות תרופות לבעיה זו. רצפים פפטידים TM יתכן גם שלא בקלות היינן במהלך ניתוח MS MALDI-TOF, ולכן יכולים לתת אותות חלשים מאוד. יש לנו להשתמש הליך אופטימלי להכנת דגימות פפטיד TM בי פתרון רווי של חומצת sinapinic (SA) באתנול, ראה לראשונה בצלחת והמיובשת לעשות שכבה דקה אחידה של מטריקס. מדגם של שבריר HPLC פפטיד המכיל מעורבים 1:01 בתמיסה רוויה של SA באצטוניטריל, ואז ראה על גבי שכבת המטריצה ​​המיובשת. בידות שלנו, תשואות בין שיטה זו ו2 יותר אות לרעש פי שישה להשוותד לאיתור פפטיד: תערובת SA ישירות על גבי צלחת MALDI נקיה. יישומים במורד זרם. שיטות עבור בנייה מחדש של מתחמי פפטיד TM לתוך מערכות שומנים או חומרי ניקוי לNMR פתרון ויישומים במורד זרם אחרים להשתנות במידה רבה ובדרך כלל חייב להיות מותאמים בקפידה לכל מערכת ויישום חדשים. דיון מלא בפרמטרים המעורבים הוא אפוא הרבה מעבר להיקף של מאמר בפרוטוקול זה. לפרטים של הכנת מדגם מיישומים מוצלחים באמצעות NMR פתרון, אנחנו מפנים את הקורא לסקירות האחרונות אלה על הנושא 1,19 והפניות בו.

בפרוטוקול זה הליך שפתחנו להפקת מתחמי דיסולפיד התייצבו-הטרנסממברני של פפטידים (TM) למחקרים מבניים באמצעות NMR פתרון. ההליך מנצל את הביטוי החזק הניתן על ידי מערכת היתוך ΔtrpLE1413 (ראה להלן) ומאפשר מתחמי פפטיד TM של הרכב מוגדר להיות שנוצר תוך שימוש בטכניקות תיוג-איזוטופ היציב מתוחכמות עבור ניסויי NMR רבי ממדים מודרניים. יש לנו מועסקים הטכניקות הללו כדי לקבוע כמה מבני NMR שחשפו מידע חדש וחשוב על איך immunoreceptors הלימפוציטים-מפעילות מורכבים מיחידות משנת חלבון קרום רבות באמצעות אינטראקציות בין תחומי TM (לאחרונה בדק ב1). טכניקות אלו חלות על מערכות רבות אחרות בממברנה חלבונים, כמו גם מגוון רחב של שיטות אנליטיות במורד זרם בנוסף לתמ&quot;ג פתרון. אמנם הדוגמא שניתנה כאן מנצלת שאריות ציסטאין ילידיםליצירה מורכבת, שמחק באופן טבעי דיסולפיד מלוכדות החלבון, העיצוב הוא מתאים באותה מידה גם ליצירת קשרי דיסולפיד מהונדסים לייצב מתחמי שבדרך כלל מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות חלשות יותר, שאינן קוולנטיים כגון הומו והטרו מתחמי TM dimeric של קולט גורם גדילה באפידרמיס חלבונים (EGFR)-משפחה 2-4 או מתחמי integrin αβ heterodimeric 5,6. רצפים פפטידים מאוד הידרופובי כגון אלה נגזרים משומני bilayer התפרסות על חלקים של חלבוני TM הם נושאים קשים ביותר למחקרים ביוכימיים וbiophysical. בנוסף להיות מאוד מאתגר לתמרן באמצעות חלבון סטנדרטי וטכניקות כימית פפטיד, הם לעתים קרובות למדי רעילים לתאים ולכן קשים לייצר recombinantly. אנחנו 7,8 ואחרים 9-11 יש לו הצלחה משמעותית לבטא רצפים פפטידים כה קשים בחיידקים כבמסגרת Carboxy-מסוףfusions לגרסה שונה של ΔtrpLE1413 הרצף נגזרת מE. coli trp אופרון 12. פוליפפטיד trpLE ~ 13 kDa מקודד על ידי רצף זה יכול להיות מיוצר ברמות גבוהות תחת אמרגן T7 והוא לגמרי מקומי לגופי הכללה בי בעיות הנוגעות לרעילות ו / או חוסר יציבות עוקפות. שינוי של הרצף על ידי תוספת של תג 9-היסטידין 13 וחיסול שאריות מתיונין וציסטאין פנימיים מרצף trpLE 14 fusions אפשר trpLE-פפטיד להיות מטוהר על ידי מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה ומתעכל באמצעות ציאנוגן ברומיד (CNBr-מסוף אמינית ) כדי לשחרר את רצף הפפטיד הרצוי. אנחנו השתמשנו בהצלחה במערכת זו כדי להביע יותר מתריסר רצפים שונים כמו fusions trpLE מייצג ברי חלבון קרום המכילים עד ארבעה תחומי TM (7,8 ותוצאות לא פורסמו; ראו סעיף דיון גם). חדשנות מרכזית בפרוטוקול זה היא זיהוי של תנאים בי fusions בלתי המובנה וצורה הגרועה מאוד מסיס trpLE-TM יכול להיות יעיל דיסולפיד crosslinked-בהקשר של זרימת עבודה יעילה. כמה היבטים של ביטוי, טיפול תשואה גבוהה וטיהור של מוצרים פפטידים גם מוטבו ביסודיות, ואת ההמלצות שהציגו כאן הן לא פחות רלוונטיות לייצור שאינם דיסולפיד crosslinked-מוצרים (monomeric) TM פפטיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ציאנוגן ברומיד </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים. מאוד רעילים בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. צור עם חומצות משחרר גזים רעילים מאוד. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. </td></tr><tr><td> חומצת Trifluoroacetic </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, מספר CAS 76-05-1 </td><td> חומר מסוכן. מוצרים מסוכנים., גורמים לכוויות קשות. מזיק בשאיפה. מזיק לאורגניזמים ימיים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. </td></tr><tr><td> 2-Mercaptoethanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, מספר CAS 60-24-2 </td><td> חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. רעיל בשאיפה, במגע עם עור ובליעה. מרגיז לעור. סיכון לניזק חמור לעיניים. עלול לגרום לרגישות במגע עם עור. רעיל מאוד ליצורי חיים במים, עלול לגרום לתופעות לוואי לטווח ארוך בסביבה המימית. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> מספר המוצר 52512, CAS-לא. 920-66-1 </td><td> חומר מסוכן. סחורות מסוכנות. מזיק בשאיפה ובבליעה. גורם לכוויות. </td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> המרק KGaA </td><td> K41186564 </td><td> נוזל דליק ואדים. יוצר כוויות קשות ולניזק לעיניים. </td></tr><tr><td> אוריאה </td><td> Univar, AJAX FINECHEM </td><td> מספר מוצר, 817, CAS-לא 57-13-6 </td><td> כאשר מחומם, דצמברomposes לפחמן דו חמצני ואמוניה, ואם נשרף, פולט כמויות קטנות של תחמוצות חנקן. יכול לגרום לאדמומיות וגירוי של עור ועיניים. </td></tr><tr><td> מושהה guanidine </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, מספר CAS: 50-01-1 </td><td> מזיק אם נבלע, גורם לגירוי חמור בעיניים, גורם לגירוי עור, רעילויות חריפות, גירוי עור, גירוי עיניים שבעל פה. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> מספר-T8532 מוצר CAS לא: 9002-93-1 </td><td> טריטון X-100 הוא חומר ניקוי nonionic, 100% חומר פעיל, המשמש לעתים קרובות ביישומים ביוכימיים לsolubilize חלבונים. X-100 טריטון אין מאפיינים מיקרוביאלית ונחשב חומר ניקוי מתון יחסית שאינם denaturing- </td></tr><tr><td> בחירתו-ג&#39;ל ניקל הזיקה </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> מספר סידורי-P6611 </td><td> ג&#39;ל זיקת ניקל IS-בחירה הוא מוצר משותק מתכת יון זיקת כרומטוגרפיה (IMAC). HIS-בחירת ניקאל זיקת ג&#39;ל הוא chelate quadridentate קניינית בחרוזי agarose הואשם בניקל, שפותח במיוחד כדי לאגד חלבונים המכילים היסטידין. </td></tr><tr><td> (-)-גלוטתיון, מתחמצן </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> מספר סידורי 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> sonicator Misonix S-3000 </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (שהופסק) </td><td> תפוקת הספק מרבי 600 ואט. חללית 1/2-inch-טיפ להחלפה לוקחת בעצמה גבוהה 1/2-inch, טיפים בנפח גבוה ומגוון בעצמה גבוהה, טיפים בנפח נמוך. מודלים הקרובים ביותר הזמינים כיום מחברה זו הם Q500 וQ700. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: מערכת כרומטוגרפיה DuoFlow ביולוגית, גרסת תוכנה 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> מספר סידורי 760-0047, Config לא: AU500571, מספר סידורי: 484BR3705 </td><td> הפפטידים נקשרו להפוך עמודות שלב HPLC בaq הגבוהשלב ונייד ueous הם eluted מעמודות RP HPLC עם שלב נייד אורגני גבוה. בRP פפטידים HPLC מופרדים מבוססים על האופי הידרופובי. פפטידים יכולים להיות מופרדים על ידי ריצת שיפוע ליניארי של הממס אורגני. </td></tr><tr><td> טור Prep HT C3 ZORBAX 300SB-אנליטי HPLC, 21.2 מ&quot;מ 150 x, גודל חלקיקים מיקרומטר 5 </td><td> Agilent </td><td> לא מוצר: 895150-909 </td><td> התהפך שלב HPLC קולום </td></tr><tr><td> Bis-טריס NuPAGE 12% ג&#39;ל </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> NP0341BOX </td><td> ג&#39;ל אלקטרופורזה היצוקה המוקדם לחלבון </td></tr><tr><td> קלטות Slide-A-G2 Lyzer דיאליזה, 3.5K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> לא מוצר: 87724 </td><td> דיאליזת מדגם </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

אינטראקציות פיסיות בין תחומי שומנים משובצים אלפא הסליל של חלבוני קרום לשחק תפקיד מכריע בקיפול והרכבה של קומפלקסי חלבוני קרום ובתהליכים דינמיים כגון הטרנסממברני (TM) איתות ובקרה של רמות חלבון על פני קרום תא. הבנת התכונות המבניות נהיגת העמותה של רצפים מסוימים דורשת ניתוחי biophysical וביוכימיים מתוחכמים של מתחמי פפטיד TM. עם זאת, hydrophobicity הקיצוני של תחומי TM גורם להם קשים מאוד לתמרן תוך שימוש בטכניקות כימית פפטיד סטנדרטיות, וייצור של חומר הלימוד המתאים לעתים קרובות מוכיח להחריד מאתגר. זיהוי תנאים שבם פפטידים יכולים לאמץ תצורות סליל יציבות ומתחמי צורה ספונטנית מוסיף רמה נוספת של קושי. כאן אנו מציגים הליך לייצור קומפלקסי פפטיד TM הטרו dimeric מחומרי הומו או שבאים לידי הביטוי בE. colאני, ובכך מאפשר שילוב של תוויות יציבות איזוטופים לתהודה מגנטית גרעינית (NMR) או חומצות אמינו לא טבעיות ליישומים אחרים יחסית זול. החדשנות המרכזית בשיטה זו היא שקומפלקסי TM מיוצרים וטהרו כמכלולים הקשורים קוולנטית (דיסולפיד crosslinked-) כי יכול להיוצר מבנים יציבים, stoichiometric והומוגנית כאשר מחדש לחומרי ניקוי, שומנים בדם או חומרים אחרים קרום כוזבים. אנו מציגים גם נהלים מותאמים בקפידה לביטוי וטיהור שחלים גם אם הפקת תחומי TM בודדים או מתחמי crosslinked ולספק ייעוץ להתאמת שיטות אלה לרצפי TM חדשים.

רמת הביטוי להושגה fusions trpLE היא משתנה ותלוי מאוד ברצף החומצות האמינו של הפפטיד המצורף. איור 3 מציג את ניתוח SDS-PAGE של טרם הגיוס (1 נתיב) וזמן של קציר (מסלול 2) דגימות מתרבות שהניבה כ 120 מ&quot;ג של היתוך טהור, שלם trpLE-DAP12TM מ1 ליטר של התרבות ומטריצת ניקל מ&quot;ל 4. כל היתוך trpLE-DAP12TM היה מקומי להכללת גוף הכדורי (מסלול 4) בניגוד לsupernatant (3 נתיבים). כ 70% מהיתוך ניקל מטוהר-trpLE-DAP12TM היה דיסולפיד-crosslinked לטופס dimeric (איור 3, נתיבים 5 ו 6: דגימות שאינן מופחתות, וירידה של eluate TFA). זו היא תוצאה אופיינית להיתוך trpLE-DAP12TM, אבל יעילות crosslinking תשתנה בהתאם למיקום של cysteines המהונדס. מוצרי פפטיד DAP12TM אינם לזיהוי בקלות בדגימות כלל CNBr לעכל (נתיבים 7, 8),אבל השוואה של ההיתוך השלם ולהקות בר trpLE במדגם העיכול המופחת (מסלול 8) מציינת שהעיכול של ההיתוך היה ~ 60% מלא. איור 4 מראה את ההפרדה של מוצרים לעכל ידי הפוך השלב HPLC באמצעות עמודת C3 preparative קנה מידה (סך יכולת קשירה ~ 200 מ&quot;ג של חלבון). בגלל התוכן הריחני של ההיתוך נמוך אנחנו בדרך כלל לעקוב אחר הספיגה ב214 ננומטר ולא 280 ננומטר. עבור 90 מ&quot;ג הטווח זה של חמצון, CNBr-מתעכל היתוך trpLE-DAP12TM הומס בחומצה פורמית מסודרת מ&quot;ל 3 והועמס על העמודה ב% ממס 100 (60% H 2 O, אצטוניטריל 40%, 0.1% TFA). מוצרי עטופות eluted בשיפוע שני שלבים של 0-60% ואחרי 60-90% B ממס (75% isopropanol, אצטוניטריל 25%, 0.1% TFA) בקצב זרימה של 10 מ&quot;ל / דקה. המוצרים העיקריים הכלולים בכל שבריר לפי ניתוח SDS-PAGE (איור 5) הם ציינו לעיל הכרומתוגרמה באמצעות קודי אסיgned באיור 2. ראה אופטימיזציה של elution השיפוע HPLC בסעיף הדיון לפרטים נוספים על תנאי אופטימיזציה הדרגתית לרצפים פפטידים שונים. מוצרי פפטיד ניתן לזהות בנקל בSDS-PAGE (איור 5) וMALDI-TOF (6 איור) ניתוחים של שברי HPLC העיקריים. פפטידים DAP12TM ו, בניסיון שלנו, הרבה פפטידים TM הידרופוביות אחרים, לרוץ עם שיעורי הגירת קטינה באופן משמעותי בהשוואה למשקל המולקולרי הצפוי שלהם (3366 דלתון מונומר ודלתון דימר 6730 עבור 15 המינים N-שכותרתו מוצגים כאן). התנהגות זו קשורה באופן ישיר לכמות פפטיד הועמסה על ג&#39;ל והתוצאות ברצף של משקלים מולקולריים לכאורה כסכום הטעון מגוון (מידע לא מוצג). עם זאת, השינוי בניידות electrophoretic של שיא 5 עם הפחתה עם DTT 100 מ&quot;מימ (השווה נתיבים 7 ו 8) מזהה זה כפפטיד crosslinkedמוצר. MALDI-TOF MS ניתוח מאשר את זהותו של פפטיד dimeric עם השיא העיקרי ב6729.2 Daltons ומגלה אין מוצרים עיקריים אחרים (איור 6). התשואה הסופית של דיסולפיד crosslinked-DAP12TM פפטיד homodimer הטהור מהיערכות זו הייתה 7.5 מ&quot;ג לליטר של התרבות. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig1.jpg" /> איור 1. רצף ה-DNA של אזור קידוד trpLE-DAP12TM עם תרגום חומצת אמינו. אזורים עיקריים של רצף פוליפפטיד מודגש וצבעים שונים עם תוויות בצד הימין. את השאריות הייחודיות הפנימיות מתיונין (MET) וציסטאין (Cys) למחשוף ציאנוגן ברומיד (CNBr) וcrosslinking חמצונים מודגשות בצבע תכלת וסגול, בהתאמה. אתרי הגבלת BamHI (מודגש ועם קו תחתון) HindIII וייחודיים בפלסמיד ואמאy לשמש כדי להחליף את רצף הפפטיד TM עם רצף נוסף של ריבית. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig2.jpg" /> איור 2. תרשים סכמטי של ההליך. השלבים העיקריים בפרוטוקול מצוין בתוויות טקסט. מגזרים עיקריים של היתוך trpLE-DAP12TM מקודדים באמצעות צבע כמו באיור 1. מוצרי פוליפפטיד עיקריים מצעדים לעכל crosslinking ומתויגים AF והם מפורטים כאן עם התיאור שלהם ומשקלים מולקולריים צפויים (15 N מתויג-): [א] שבר trpLE: 13769 Daltons; [B] היתוך שלם trpLE-DAP12TM: 17118 Daltons , [ג] שלם trpLE-DAP12TM היתוך דימר: 34233 Daltons; [ד] היתוך יחיד בקע trpLE-DAP12TM דימר: 20482 Daltons; [E] monomeric DAP12TM פפטיד: 3366 Daltons; [F] dimeric DAP12TM פפטיד: 6730 Daltons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50141/50141fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח SDS-PAGE של צעדי הביטוי, טיהור, crosslinking ולעכל trpLE-DAP12TM דגימות תרבות (1 מסלול, טרם גיוס, צעד 2.5; נתיב 2, קציר, צעד 3.1). ודגימות prep גוף הכללה (3 נתיבים, supernatant; נתיב 4, גלולה; צעד 3.4) הופחתו עם DTT mM 100. eluate TFA מטור ניקל (נתיבי 5 ו 6; שלב 6.1) ומדגם שלאחר CNBr (נתיבים 7 ו 8; צעד 6.3) היה לרוץ אינם מופחת (NR) ויורדת עם 100 המ&quot;מימ DTT (R) כפי שצוין כדי לאשר דיסולפיד-crosslinked מוצרים. * מוצר פפטיד monomeric וdimericשל E ו-F הן גרוע דמיינה ידי מכתים Coomassie ולכן לא ניתן לגילוי בג&#39;ל זה. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig4.jpg" /> איור 4. טיהור התהפך שלב HPLC של דימר DAP12TM דיסולפיד-crosslinked. חמצון, CNBr מתעכל וlyophilized מוצרי היתוך trpLE-DAP12TM (90 מ&quot;ג) שהומסו בחומצה פורמית 3 מ&quot;ל (100%) והועמסה על Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT (21.2 x 150 מ&quot;מ) בטור ממס (60% H 2 O, אצטוניטריל 40%, 0.1% TFA). שיפוע בשני שלבים של 0-60% ואחרי 60-90% B ממס (75% isopropanol, אצטוניטריל 25%, 0.1% TFA) היה לרוץ בקצב זרימה של 10 מ&quot;ל / דקה לelute מוצרים קשורים. שברים שנאספו כזרימה דרך (FT) וארבע פסגות עיקריות מסומנות מעל העקבות הספיגות 214 ננומטר (AU: שרירותי בלתי) שלה ואת המוצרים העיקריים הכלולים בכל חלק מסומנים באמצעות קודים שהוקצו באיור 2. שיא המוצר הרצוי DAP12TM crosslinked מוצללת. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig5.jpg" /> איור 5. ניתוח SDS-PAGE של מוצרי HPLC הפוך-שלב. זרימה דרך (FT) והשיא 1 דגימות הורצו אינן מופחת. שיא 2, 3 ו 4 דגימות להריץ גם אינן מופחת (NR) ומופחתת על ידי טיפול עם 100 המ&quot;מימ DTT (R) כדי לאמת את הזהות של מוצרי דיסולפיד crosslinked. המוצרים העיקריים בכל שבריר (עם הקודים שלהם הוקצו באיור 2) היו [FT, Pk1]: בר, trpLE; [Pk2]: B, בשלמות trpLE-DAP12TM ההיתוך מונומר ו-C, דימר היתוך השלם; [Pk3]: ד &#39;, אחת בקע trpLE-DAP12דימר TM ו-E, monomeric DAP12TM פפטיד; [Pk4]: F, דימר DAP12TM דיסולפיד-crosslinked. * כפי שנדון (ראה REULTS ייצוג), משמרת ריכוז תלוי בניידות הופכת את המוצרים נמוכים MW בPk3 (ע&quot;נ ו R) וPk4 (R) להיראות משקולות מולקולריות שונות למרות ששני המוצרים הם פפטיד monomeric. <img alt="איור 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50141/50141fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50141/50141fig6.jpg" /> איור 6. ניתוח MALDI-TOF המוני spectrometric של HPLC-מטוהרי DAP12TM פפטיד דימר. מדגם של שבריר HPLC 4 (μl 1) היה מעורב 1:01 בתמיסה רוויה של חומצת sinapinic (SA) במטריצת אצטוניטריל והבחין על גבי שכבה דקה של מטריצת SA מיובשת מפתרון המוכן רווי באתנול. ניתוח MALDI-TOF חושף מוצר בפפטיד DAP12TM הצפוי crosslinked דימר המונישל 6730 Daltons (6729.2098; 15 N מתויג-), כמו גם מוצרי קטין ב3365.7105, סביר להניח שהמינים כפולים המיוננים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50141/50141fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies at JoVE.com

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גרעינית פתרון (NMR) ויישומים אנליטיים אחרים.

מכלולי פפטיד הטרנסממברני ייצור של דיסולפיד-התייצבו ללימודים מבניים

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Google

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K Views.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. מחקרי Biophysical והביוכימי של אינטראקציות בין חלבוני קרום תחומים מוטבעים-להתמודד עם אתגרים טכניים רבים, הראשונה שבן היא קבלת חומר הלימוד מתאים. מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקה וטיהור מתחמי פפטיד הטרנסממברני דיסולפיד-התייצב המתאימים לניתוח מבנים על ידי תהודה מגנטית גר?...

Video: Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

אלקטרופורזה הנימים לפקח פפטיד האריך על Chitosan סרטים בזמן אמת

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

נשלט Photoredox הפילמור טבעת-פתיחה של O- Carboxyanhydrides מתווכת על-ידי Ni/Zn מתחמי

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

הכנת יציב Aziridinium Bicyclic יונים, פתיחת הטבעת שלהם לסינתזה של Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

טכניקות הרומן להתבוננות מבניים הדינמיקה של גביש נוזלי Photoresponsive

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

הכנת SNS קובלט (II) מכלולי מודל מודלים של הכבד אלכוהול דהידרוגנאז

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.