פרוטוקול זה מרחיב את בדיקת פצע הגירוד הנפוצה מאוד המשמשת למחקרי התחדשות עם מונולרים שמקורם באנטרואיד המייצגים את כל סוגי התאים העיקריים של המעי הדק. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של סגירת פצעים במודל חד-שכבתי דו-ממדי פג של התחדשות מעיים. הטכניקה שלנו יכולה להיות מיושמת בחקר מעיים של יונקים פגים, שבדרך כלל מעוצבים בצורה גרועה באמצעות קווי תאים של סרטן המעי הגס שעברו טרנספורמציה.
התחילו בהפשרה של 96 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית, או הידרוג'ל BME מבוסס ECM, למשך הלילה על קרח בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס. דלל הידרוג'ל מבוסס ECM ו-PBS קר כקרח ללא סידן או מגנזיום ביחס של אחד עד 50. מצפים כל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות עם 200 מיקרוליטרים של הידרוג'ל מדולל קר כקרח על בסיס ECM ודוגרים על הצלחת המצופה למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
לאחר מכן שאפו את המדיה מצלחת התרבית בת 24 הבארות המכילה את האנטרואידים התלת-ממדיים המיועדים למונו-שכבות והחליפו אותה ב-500 מיקרוליטרים של מגיב דיסוציאציה של תאים לכל באר. לשבש באופן ידני את כיפות ההידרוג'ל המבוססות על ECM על ידי צנרת למעלה ולמטה שמונה עד 12 פעמים והעברת התוכן של 12 בארות לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לשטוף את 12 בארות ריקות עם 250 microliters של מגיב דיסוציאציה התא כדי להבטיח את כל enteroids הוסרו ולהעביר את התוכן צינורות חרוטיים 15 מיליליטר.
צנטריפוגה של צינורות חרוטיים ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. הוסף 10 מיליליטר של חיץ כביסה DMEM/F-12 קר כקרח לצינורות החרוטיים והשעה את הכדורים האנטרואידים על ידי היפוך הצינורות. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant.
השהה את כדורי התא ב 12 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס טריפסין-EDTA והנח את הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות או עד שהתאים נראים מסיסים. הוסף שלושה מיליליטר של מאגר כביסה DMEM/F-12 לכל צינור כדי לדלל טריפסין-EDTA. מערבבים על ידי היפוך הצינורות ומניחים על קרח.
סנן את האנטרואידים המנותקים דרך מסננת תאי רשת בגודל 37 מיקרומטר. לאסוף את התוכן לתוך צינורות חרוטיים נקיים 15 מיליליטר צנטריפוגה את הצינורות ב 300g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מן צינורות חרוטי להשעות את כדורי התא עם שישה מיליליטר של HOMGY.
לאחר מכן, הסר את צלחת ציפוי ההידרוג'ל מבוססת ECM מהאינקובטור ושאף כל תמיסת הידרוג'ל עודפת מבוססת ECM מבלי לשרוט את פני השטח המצופים או לייבש לחלוטין את הצלחת. הוסף 500 מיקרוליטרים של תרחיף תאי HOMGY המשולב של 12 מיליליטר לכל באר של צלחת 24 באר המצופה בהידרוג'ל מבוסס ECM. סובבו את הצלחת עם המכסה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים בתוך הבארות.
דגירה של הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, תוך החלפת מדיית HOMGY כל יומיים עד שהמונו-שכבות מגיעות ליותר מ-90% מפגש. ברגע שהמונו-שכבות מגיעות ליותר מ-90% מפגש, שאפו את המדיה כדי להסיר תאים שלא מצליחים להתחבר. לטפל בתאים עם 500 microliters של HA35 או PBS מומס HOMGY במשך 24 שעות.
לאחר מכן, להסיר את התקשורת מבלי לשבש את פני השטח של monolayer. באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, צור שריטה ליניארית על פני קוטר המשטח המלא של המונולייר בכל באר, תוך זהירות שלא לתת למונוליירים להתייבש. לשטוף את monolayers שרוט פעם אחת עם 500 microliters של 1X PBS ולהוסיף 500 microliters של HA35 או PBS מומס HOMGY.
מעבירים את הצלחת למכשיר ניתוח התאים החיים בתוך אינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. תחת סמל לוח הזמנים בתוכנת ניתוח התאים החיה, לחץ על הפעל הוסף אשף כלי שיט חדש סמל. בחר סרוק לפי לוח זמנים ולאחר מכן לחץ על הבא.
בחר חדש תחת צור כלי ולחץ על הבא, ולאחר מכן בחר באר שלמה תחת סוג סריקה ולחץ על הבא. בחרו 'פאזה' לערוצי תמונה ו-4x למטרה. בחר את יצרן הצלחת ואת המספר הקטלוגי מהרשימה שסופקה ולחץ על הבא.
בחר מיקום כלי ריק ואחריו תבנית הסריקה הרצויה. הזינו את שם הלוחית ב'שם', ולאחר מכן בחרו 'פלוס' כדי ליצור פריסת לוחית. בחר פלוס קטן כדי ליצור שם טיפול.
הזן שם קצר ולאחר מכן אישור. הדגישו את בארות הצלחת המתאימות לטיפול זה ופגעו בפלוס גדול כדי לייעד בארות עם טיפול זה. הזן ריכוז מורכב ולחץ על אישור. לאחר השלמת הצלחת, בחר אישור, הבא. בחר דחה ניתוח למועד מאוחר יותר ולאחר מכן צור לוח זמנים חדש עם סריקות במרווחים של ארבע שעות.
להפסיק את הסריקה ביום אחד, שעות אפס. ודא שהסיכום נכון ולאחר מכן הוסף ללוח הזמנים. בתוכנת ניתוח תאים חיים, בחר תצוגה בחלק העליון של המסך.
מתפריט שם כלי שיט, נווט אל הסריקה שהושלמה תוך 24 שעות ולחץ פעמיים על שם כלי השיט. בחר ייצוא תמונות וסרטים סמל משמאל ואחריו האפשרות כפי שמוצג. סמן את הבארות המעניינות ולאחר מכן בחר נקודות זמן מעניינות וסדרות של תמונות כפי שהן מוצגות.
ודא שסוג הרצף והסריקות נכונים. בחר את מיקום תיקיית היעד הרצוי. בחר JPEG מהתפריט הנפתח ולאחר מכן יצא.
פתח את תוכנת ImageJ והעלה את תמונת בדיקת פצע השריטה. בחר/י ״תמונה״ ולאחר מכן הקלד/י 8 סיביות כדי לשנות את התמונה מ-RGB של 24 סיביות. בחר תוספים, פקודות מאקרו, התקן Wound_healing_size תוסף כדי להתקין את התוסף בגודל ריפוי פצעים.
לאחר מכן, הגדר את רדיוס חלון השונות ל- 20, ערך הסף ל- 100, אחוז הפיקסלים הרוויים ל- 0.001. כן עבור הגדר קנה מידה גלובלי ולאחר מכן לחץ על אישור. יש לוודא שהאזור המסומן הוא אזור הפצע ולחזור על הפעולה לשריטות נוספות. לבסוף, חשב את אחוז הריפוי של פצעי אזור הגירוד של תאים נודדים או מתרבים במשך 24 שעות באמצעות המשוואה המוצגת על המסך.
כאן, T0 הוא האזור בזמן אפס שעות, ו- TC הוא האזור בשעות אפס, ארבע שעות, 12 שעות, או 24 שעות. יצירת אנטרואיד והליך בדיקת ריפוי פצעים חד-שכבתי שמקורו באנטרואיד מוצגים בתמונות אלה. תרבות של אנטרואידים תלת-ממדיים, שאינם אנושיים, משמשת להתנתקות למונולרים דו-ממדיים.
מונו-שכבות גודלו למפגש של יותר מ-90% בצלחת של 24 בארות ולאחר מכן טופלו ב-HA35 או PBS במשך 24 שעות. לאחר מכן נשרטו מונוליירים עם קצה פיפטה P200. מוצגות כאן התמונות המייצגות של HA35 בטיפולי בקרה של מונולרים אנטרואידים של פרימטים לא אנושיים.
התמונות התקבלו בשעות אפס, ארבע שעות, 12 שעות ו-24 שעות לאחר ביצוע שריטה עם קצה פיפטה P200. ההשפעה של HA35 על ריפוי פצעים ומונולרים של זיהוי פצעים מוצגת כאן. השינוי בריפוי פצעים לאורך זמן במונו-שכבות אנטרואידיות תלוי בריכוז הטיפול ב-HA35.
HA35 העלה משמעותית את ריפוי הפצעים לאחר ארבע שעות ו-12 שעות ב-100 מיקרוגרם למיליליטר ו-200 מיקרוגרם למיליליטר בהשוואה לקבוצת הביקורת, אך שיעורי הריפוי התכנסו בין הטיפולים ב-24 שעות. אחד הדברים החשובים ביותר שיש לזכור עם הליך זה הוא כי monolayers אנטרואיד מעיים הם קצרי מועד. לכן, ברגע שהם מתבלבלים ב-90%, החוקרים צריכים לחפש להשתמש בהם במהירות.
טכניקה זו הפכה למודל שלנו להתחדשות מעיים מוקדמת במבחנה, במיוחד אם אנו מעוניינים בפגיעה מכנית יותר מאשר דלקתית.
