פרויקט זה נתמך על ידי NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, מח' כספים הפצתו למדעי קלינית

עבור ניסויים אלו, מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של צפון קרוליינה סטייט.
1. הכנה תרבות
הערה: כל ריאגנטים מפורטים בטבלה של חומרים. גורם גידול ספציפי ריכוזים מפורטים בטבלה 1.
<ol><li>להכין פתרון חומצה (EDTA) ethylenediaminetetraacetic 0.5 M במים מזוקקים יונים (ddH2O). לערבב במידה מספקת, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 שימוש בפתרונות NaOH ו/או HCl. הערה: להמציא פתרון מניות EDTA טריים לפני ניסוי.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה מגיב #1 (ד ר #1) כדלקמן ומניחים על הקרח: לשלב פוספט buffered תמיסת מלח ללא Ca2 + ו- Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, מ' 1 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 מיקרומטר Y27632 פתרון 1 X אנטיביוטיקה-Antimycotic (אנטי-נגד) המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו- b שהוא גוסס הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה ריאגנט #2 (ד ר #2) כדלקמן, מניחים באמבט מים 37 ° C: לשלב PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 1 אנטי-נגד X. הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין מדיה תא גזע אפיתל המעי (IESC) כדלקמן: מיקס 25 מ ל מתקדמים DMEM/F12 בינוני עם תוספת X N2 1, 1 X B-27 תוספת, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ Glutamax ו- 1 אנטי-נגד X. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	<li>להכין תערובת בסיס של פקטורי גדילה מופחתת קרום המרתף מטריקס (matrix) גורמי גדילה משלימה כדלקמן: הפשרת המטריקס על קרח. בשפופרת microcentrifuge, להוסיף 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי בשכל אנושי, 500 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי R-Spondin 1, 50 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושית Wnt3a, 10 מ מ Nicotinamide, גסטרין 10 ננומטר, 500 ננומטר A-83-01, 10 מיקרומטר Y-27632 , 10 מ מ SB202190, 500 nM LY2157299 ו 2.5 מיקרומטר גליקוגן סינתאז קינאז 3 מעכב (GSK3i, CHIR99021). כאשר מופשר המטריקס הוא, להשלים עם המיקס פקטורי גדילה (ביצוע מיקס מאסטר) ולאחסן על קרח. הערה: הקפד להימנע מהחדרה בועות אוויר כמו פעולה זו תיצור החפץ בתוך פטי מטריקס במהלך ציפוי.</li>
	<li>לחמם תבשיל תרביות רקמה 24-ובכן בחממה 37 ° C לפני הפעלת נוהלי בידוד תא.</li>
</ol>2. ניתוח מודל של איסכמיה ואוסף רקמות
<ol><li>השתמש שמונה יורקשייר בן שבוע 10 crossbred חזירים של מין או (מומלץ). הסר כל הזנה 16-18 שעות לפני הניתוח. אפשר חזירים גישה למים בכל עת.</li>
	<li>לתזמן את החזירים להגיע לפחות 48 שעות לפני הניסויים כדי לאפשר להתאקלמות סביבתיים. הערה: טכנאי וטרינרי ו/או מעבדה מיומן בפיקוח וטרינר מורשה לספק טיפול בבעלי חיים שגרתי וסיוע עם הרדמה הליכי.</li>
	<li>Premedicate החזיר עם חריגות השירותים הווטרינריים (1.5 mg/kg intramuscularly (IM)), קטמין (11-20 מ"ג/ק"ג (IM))15. ברגע התוצאות התקבלו להנשים את orotracheally חזיר.</li>
	<li>לשמור על חזירים בהרדמה כללית עם איזופלוריין (2-5%) מתאדה 100% O2 עד הזמן של המתת חסד.</li>
	<li>המקום של קטטר (IV) תוך ורידי (הווריד האוזן מומלץ) ולפקח על החלפת נוזל כגון פלאפונים lactated פתרון בשיעור אחזקה של 15 מ"ל/ק"ג/שעה.</li>
	<li>ביצוע הרדמה ניטור כולל אוקסימטר, אלקטרוקרדיוגרם מדידות לחץ דם עקיף15. לפקח על קצב נשימה והמאמץ של החזיר. ותאוורר באופן ידני או מכנית לפי הצורך, אם הקצה גאות CO2 עולה מעל 55-60 מ מ כספית. הערה: ההרדמה המתאימה אושר על ידי ניטור מתמיד של מגמות של קצב הלב (טווח 80-130 פעימות לדקה), לחץ דם לא פולשנית (ממוצע לחץ הדם בעורק 75-100 מ מ כספית), ואת קצב נשימה (10-25 נשימות לדקה)16ובדיקת תקופתי להיעדרות של הלסת וגוון אנאלי. עומק ההרדמה יכולה להישפט גם על ידי הרפיית שרירים ורמת fasciculation שרירים בעקבות גירוי כירורגי. רפלקסים עינית בדרך כלל אין ערך16. ניתן לספק שיכוך כאבים לפי המדיניות IACUC מוסדות. במקרה זה, אופיואידים, כגון הבופרנורפין, יכול להינתן במהלך הניתוח.</li>
	<li>במקום החזיר על כרית החימום, לרסן ב recumbency הגבי עבור הליך כירורגי.</li>
	<li>לגלח את הבטן הגחון ולהכין שימוש בניתוחים כירורגיים (chlorhexidine פתרון), איזופרופיל אלכוהול.</li>
	<li>לעשות חתך קו האמצע הגחון 8-10-ס מ באמצעות להב סכין מרוכז בכל הטבור כדי לגשת בבטן.</li>
	<li>לזהות את המעי הדק (מעי צם) כ-40 ס מ אורלי כדי שתוריד. ניסחו לולאות זמן 10 ס מ של מעי צם מאת circumferentially נבדק פעמיים את המעי הגס, 1 ס מ בין כל קשירה, לפני יצירת עוקבות לולאות 10 ס"מ ממוקם אורלית (איור 1).</li>
	<li>צור שתי לולאות לכל נקודת זמן איסכמיה סמוכים זה לזה, אחד עבור איסכמיה ואחד עבור איסכמיה h 1 נוספים של פגיעה reperfusion במידת הצורך. כדי ליצור שלם איסכמיה (אין זרימה של עורקים או ורידים), מלחציים או מאתרים ומפסיקים את להערכת מצע המעי העליון באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג, טוב נגד יתושים מהברים מעוקל או משי נספגים 2-0 עבור 1, 2, 3 ו- 4 שעות ולאחר מכן להסיר את אבזמי h 1 של פגיעה reperfusion, אם רצונך בכך. הערה: המחברים ברא כל לולאות של איסכמיה לפי סדר, החל עם הלולאה איסכמי 4 שעות והוא התקדם עובר הציר הקרוב (לצמצם את זמן הניתוח הכולל). כדי להתייחס לאפשרות כי השכנה איסכמי קטעי המעי עלול לגרום נזק לולאות סמוכים, הסדר של לולאות איסכמי יכולים להיות מגוונים. זה עשוי לשנות את הזמן כירורגי הכולל. הערה: מסגרת הזמן של פגיעה reperfusion יכולים להיות מגוונים בהתבסס על שאלת המחקר מעניינים או אם טיפולים רוצה להיבדק בתקופה פגיעה reperfusion. עם זאת, נזק לרקמות הופך חמור יותר מהעלאת המשכים של איסכמיה לבד, פגיעה reperfusion פגיעה סביר שאינה תורמת דבר נוסף אפיתל פציעה. פגיעה reperfusion ככל הנראה תפקיד בעקבות תקופות מתון של איסכמי.</li>
	<li>בין נקודות זמן איסכמיה, להשאיר את הבטן מכוסה או סגור באמצעות מגבת נקיה ו/או מגבת מלחציים. הערה: בתוך חיים בודד עבור ניסוי זה, שמונה מקטעים איסכמי יכולים להיווצר. זיהוי מקטע jejunal נוספים, מקורב ללולאה האחרונה איסכמי, שישמש כפקד נורמלי פנימי לפחות 5-10 ס"מ.</li>
	<li>לחסום כ שלוש ספינות מצע המעי העליון לכל קלאמפ וסקולרית בולדוג או מעוקל מהברים יתושים עוצר דימום. יש לנקוט במהלך היישום עוצר דימום בגלל כלי הם בטראומה בקלות. לנסות מחסנית בכלי הדם בתוך מלתעות המלחציים.</li>
	<li>בסוף הניסוי, המתת חסד הבאים עם פנטוברביטל 85-100 מ"ג לק"ג IV, לאסוף את כל לולאות של רקמה באמצעות קורות חיים, לאחר המוות אושרה עם אין דופק auscultated ואובדן הקרנית. התחל על ידי איסוף חתיכה שליטה של מעי צם נורמלי לפחות 5 - 10 ס מ proximal ללולאה האחרונה איסכמי.</li>
	<li>להפריד ולאחסן את. לולאות של כל נקודת זמן פציעה במכלים קטנים של PBS קר כקרח עד מוכן לבידוד הקריפטה. הערה: אם רצונך בכך, להפוך איסכמי לולאות מספיק זמן כדי לחלק את הדוגמאות נפרדים עבור היסטולוגיה והתרבות תאי גזע מעיים; עם זאת, המחברים מצאו לולאות גדול מכ 10 ס מ באורך סביר ביותר להפוך דימומית.</li>
</ol>3. קריפטה (תא גזע) בידוד מן איסכמי ולולאות שליטה
<ol><li>היפוך כל לולאה של המעי הדק באמצעות 20 גאייג-חוט רקמה מלקחיים לחשוף את השטח הרירית. לקשור העליון והתחתון של הלולאה בצורה מאובטחת לכבל באמצעות תפרים (2-0 נספגים משי או שווה ערך).</li>
	<li>לאחר היפוך, לשטוף כל לולאה ב- PBS קר קרח כדי להסיר את הלכלוך luminal.</li>
	<li>מקם דגימות ישר לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, המכיל ד ר #1 על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאסוף את לולאות מתחיל עם שליטה ופעל עם לולאות להגדיל בהפרש קבוע המשכים של איסכמיה. לולאות של רקמות שנפגעו פחות (כלומר שליטה ו- 1 h איסכמי רקמות) יכול רועד בחוזקה, הצמדה בשורש כף היד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. רקמות רקמות שנפגעו קשות (h 3 ו 4 של איסכמיה) צריך בעדינות שולט או הפוך רק כפי רועדות מדי יגרום הפרעה קריפטה והרס רקמות נוספות. צינורות צריך להיות מזועזע או הפוכה כל 5 דקות בזמן על קרח.</li>
	<li>העברת דגימות לתוך ד ר #2 10 דקות באמבט מים 37 º C. לנער או היפוך צינורות בכל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, centrifuge הצינורות חרוט המכיל ד ר #1 מ- 2-4 h פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה אפשרי שכבר יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר דגימות של ד ר #2 ולמקם דגימות רקמה ישירות לתוך 25 מ של PBS קר על קרח (תווית כמו שטיפת #1). מניחים את הדוגמאות על תפקודי לב / נשימה-קרח-סל ד 60. להמשיך ללחוץ או היפוך כל שפופרת ב-30 s כל 2-5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, ספין הצינורות חרוט המכיל ד ר #2 מהתופת 2-4 פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה זה אפשרי כי יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר aliquot 50 µL מ לשטוף #1 (או מ- DR) כדי לבדוק את מידת קריפטה דיסוציאציה, כמות פסולת. למקם את רקמת צינור חרוטי 50 מ ל (שטיפת #2, #3, וכו) מלא עם 25 מ של PBS קר ו- shake עד כוכים שלם מבודדים עם הלכלוך מינימלי, villi. הערה: המטרה היא היכולת לבודד חלק נקי עם כוכים שלם ופסולת מינימלי. כל כביסה נוספים ינקה את התאים אולם מדי רועד יתחילו לגרום נזק משני הרקמה תא. יתר על כן, התוצאות הטובות ביותר עם זיהום לפחות תושג אם כוכים הם מצופים צעד לשטוף ולא צעד ריאגנט דיסוציאציה.</li>
	<li>להסיר את הרקמה הנותרת, centrifuge השפופרות חרוט 50 מ ל- 200 גרם x 5 דקות כדי להסיר את תגובת שיקוע, לאחר מכן resuspend נותרת בגדר התת-קרקעי בנפח קטן יותר ל- PBS (5 מ"ל).</li>
	<li>שימוש במיקרוסקופ הפוכה, בחן 50 aliquots µL של כל דגימה כדי לקבוע מספר כוכים/שבר. המטרה היא 50-100 כוכים/50 µL, כמו זה יהיה בגודל של פטי מטריקס הסופי. הערה: אם המדגם הוא מרוכז מדי, להמשיך להוסיף PBS קר עד הריכוז הרצויה. אם המדגם הוא גם שתדללו, לקבוע מספר aliquots הדרושים כדי להשיג תשואה קריפטה הרצוי ולהתאים.</li>
	<li>אמצעי אחסון המתאים aliquot של כוכים (שנקבע על ידי תצפיות aliquot) לתוך צינור microcentrifuge. לדוגמה, אם לדוגמה מכיל 50 כוכים/50 µL ואז aliquot µL 50 לכל פטי משכפל X 3 = 150 µL / microcentrifuge צינור. אם המדגם מכיל רק 25 כוכים/50 µL ואז aliquots 2 הצורך / פטי X 3 משכפל = µL 300/צינור.</li>
	<li>צניפה כוכים ב g x 200 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בעדינות resuspend מגורען כוכים עם נפח מתאים של מיקס מאסטר (50 µL לכל טוב). לערבב ביסודיות על ידי במהירות pipetting 15 פעמים ללא יצירת בועות אוויר. הערה: מגניב מראש את הטיפ פיפטה תסיים סטרילי קר לפני כ רפה בעברית את תערובת הבסיס. זה יעזור למנוע את תערובת הבסיס מתפשט. טיפים יכול להיות גם לשמור במקרר, להציב בשכונה מיד לפני השימוש.</li>
	<li>מדבקות/ברקודים של מיקס מאסטר µL 50 פלוס קריפטה droplet לתוך המרכז של כל טוב של צלחת מראש ומחוממת טוב 24.</li>
	<li>דגירה לצלחת תרבות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כיסוי כל פטי מטריקס עם 500 µL / טוב של IESC מדיה (אין צמיחה גורמים נוספים הדרושים ביום 0 הם כלולים בתוך המיקס מאסטר).</li>
	<li>להוסיף 500 µL PBS סטרילי כל בארות שאינם בשימוש השאיר על הצלחת לשמור על הלחות.</li>
	<li>ספירת מספר כוכים מצופה ביום 0. הערה: זה עוזר לרשת קדם כל תא תרבות צלחת לתוך הגזרות כדי להבטיח ספירה מדויקת יותר.</li>
	<li>מספר enterospheres כל 24 שעות ונטר לפיתוח enteroid מדי יום.</li>
	<li>הוסף גורמי גדילה על כל ה 48 טוב כל התקשורת IESC h 96 כל להסיר ולהחליף עם 500 µL טריים מדיה (גורמי גדילה ואז להתווסף מדיה).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation.">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li><li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+gastrointestinal+ischemic+injury.">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury:+progress+and+promise+for+translational+research.">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li><li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair:+the+best+offense+is+a+good+defense.">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li><li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+clinical+manifestations,+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury.">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li><li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury.">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li><li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+models+of+digestive+disease:+the+future+of+large+animal+translational+research.">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids-Current+and+future+applications.">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy.">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li><li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease.">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li><li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging &amp; Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).</li><li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).</li><li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation.">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li><li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine.">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li><li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine.">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li><li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ischemia/reperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event.">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li><li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia.">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li><li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CCN1+(Cyr61)+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia/reperfusion.">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li><li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+intestinal+ischemia-reperfusion+injury.">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפיתוח של מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי ומרחיב על דגמים קודמים מאתר ומאפשר לימוד נקודות מרובות זמן הפגיעה רקמות בתוך אותה חיה. ישנן מספר נקודות לדיון ביקורתי של פרוטוקול זה כולל כלי ראוי מצדו, פגיעה reperfusion רקמות, תרבית תאים קריפטה מוצלחת.
כלי ראוי מצדו חיוני ליצירת דגם של איסכמיה מלאה. אם התפר קשורה באורח לא אחיד או המלחציים לא התהדקו לחלוטין, דם העורק בעובי דופן עלולה להמשיך להזין את הרקמה ולא יכול לצאת בשל קריסת הווריד דקות קיר. התוצאה היא extravasation של דם לתוך פרופריה. מוסקולריס גרימת נזק לרקמות נוספים. עם זאת, בהתאם לסוג הפגיעה איסכמי נחקר, איסכמיה מלאה או מדמם עשוי להיות הרצוי. לדוגמה, בתהליך של השתלת מעיים, המעי הגס מופרד לחלוטין מפני אספקת הדם (עורק, וריד) במהלך השלב כריתה של ההליך, דבר המתבטא איסכמיה מעיים מלאה. לחלופין, לעומת זאת, כאשר מצע המעי הוא מעוות במהלך אירוע כגון התפתלות המעים מעיים, השיבה ורידים לעיתים קרובות נחסמת קודם, המוביל דם נוסף בתוך רקמת לפני הישות אספקת העורק חסום, ובכך ליצור איסכמיה דימומית.
איסכמי גורמת נזק לרקמות מתחיל בקצה סיסי והארכת עד הבסיס של קריפטה3. במהלך איסכמיה, אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט ימשיך לשמש ומייצר את hypoxanthine מטבוליט. כאשר הרקמה הוא reperfused עם חמצן, hypoxanthine הופך מטבוליזם על ידי אוקסידאז xanthine ומייצרת סופראוקסיד רדיקלים חופשיים שמוביל לפציעה הרירית ואטרקציה של רקמת נזק נויטרופילים17,18. הבדלים בין המינים הרירית אדריכלות כלי הדם, כמו גם ביטוי בדרגות שונות של xanthine אוקסידאז, לגרום בדרגות שונות של פגיעה reperfusion פציעה3. מודלים של חתולים, מכרסמים של איסכמיה-פגיעה reperfusion רגישים יותר לפגיעה פגיעה reperfusion חמצן תגובתי מטבוליטים19,20. לעומת זאת, חזירים נמצאו יש פחות אוקסידאז xanthine ופציעות ולכן פחות פגיעה reperfusion, ביצוע מודל זה דומה יותר לזה של איסכמיה מעיים אנושיים21. בשלב זה, השימוש של מודלים חזירי מהונדס ללמוד פגיעה במעיים או נוק לא תואר, ממציא זה מגבלה עיקרית של מודל זה. הבחירה של המודל בעלי חיים תקין תלוי תהליך המחלה או תנאי ספציפי החוקר מבקש ללמוד. לדוגמה, מודלים חזירי של נזק איסכמי ועד 6 h כבר מתואר22, בעוד נהלים איסכמי ביותר במודלים מאתר 45-60 דקות23.
הבידוד מוצלח של כוכים מעיים מן המעי נורמלי ופגועות ischemically מאפשר המחקר של שחזור אפיתל בתרבות. מערכת זו מאפשרת החוקר להתמקד באופן ייחודי על האפיתל לבד, כפי שאין אספקת דם לא או רכיב תא החיסון לשקול. זה מציע הזדמנות ללמוד אינטראקציות תאים אפיתל ושחזור בעקבות פגיעה בנוסף תגובת גורמי גדילה שונים, או הטיפולים במהלך הניתוח או בידוד קריפטה הבאים להשלים את המדיה תרבות. שלב זה נותר הקשים ביותר, כמו בידוד של לולאות נפגע קשות דורש טלטול עדין והסרה מהירים של הפתרונות המכילה EDTA במקרה כוכים יש להפוך בטרם עת חלופה מועדפת. אם אלה לולאות המעי לא נשטפים ביסודיות, כוכים יש פוטנציאל תזדהם בתרבות. כתוצאה מכך, הוסיפו אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון שני פתרונות ד ר בנוסף למדיה IESC. עוד נקודת הדיון מתמקד המעי שנאספו כפקד נורמלי. כמו בעלי החיים עוברים הרדמה עם שינויים אפשריים זלוף רקמות מערכתית, יחד עם האפשרות של מחזורי מתווכים דלקתיים משני איסכמיה, אפילו "נורמלית" שליטה רקמות לא מייצג פקד אמיתי. בניסויים אלה, זה של הערה כי הרקמה שליטה הופיע בגסות וללא בהיסטולוגיה להשוות ברקמות של בעלי חיים, כי לא עברה איסכמיה בניסויים אחרים (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
לסיכום, מתאר שיטה זו מודל לשחזור של חזירי איסכמיה מעיים, זה מקרוב מודלים מה מתרחש בפציעה איסכמי אנושי. בנוסף, מתוארת הבידוד של תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי, אשר מגישה ללמוד היענות לטיפול בתרבות ותיקון אפיתל.

נזק איסכמי מעיים, התוצאה של זמינות החמצן ירד עקב צמצום או סגר מוחלט של זרימת הדם אל המעי, נותרה מטרה משמעותית של תחלואה ותמותה בחולים אדם ובבעלי1,2. נזק איסכמי, שלאחר דלקת, חדירה תאית, מוביל לפגיעה מכשול הרירית. המכשול הרירית חיוני למניעת רוברטסונית חיידקים ורעלים המשויך לתוך מחזור מערכתי3,4. פגיעה reperfusion עוקבות של רקמות איסכמי יכול לגרום היווצרות של מינים חמצן תגובתי זה יכול להחמיר פציעות5פגיעה. מאז איסכמיה מעיים הוא לעיתים רחוקות למניעה, המחקר העדכני ביותר התמקדה בקידום טכניקות גילוי מוקדם של איסכמיה ופיתוח של רומן גישות טיפוליות להפחית פגיעה reperfusion פציעה או היעד לתיקון הרירית.
חייתיים היו בשימוש נרחב מדע בסיסי הידע של איסכמיה-פגיעה reperfusion פגיעה ולהישאר הכרחי עבור המחקר translational. מודלים מכרסם כבר בשימוש נרחב ביותר בשל היכולת שלהם להיות גנטי6. לאחרונה עם זאת, השימוש של דגמים בעלי חיים גדולים, במיוחד את החזיר כבר דגלו ללימודי translational בעתיד עקב מספר יתרונות כולל חזירים אנטומיים, הפיזיולוגיות הדמיון בני7,8. מגוון דגמים פציעה פותחו ללמוד איסכמיה-פגיעה reperfusion פציעה ואף כוללים חסימת כלי דם מלאה, איסכמיה תזרים נמוך, סגמנטלי מצע המעי העליון חסימת כלי דם. לסקירה מלאה של מודלים אלה הוא מחוץ לתחום של מאמר זה אולם המחברים ישיר לקוראים סקירה האחרונות3.
בנוסף אין ויוו מודלים, השימוש במערכות שמחוץ לתרבות הסלולר מציע כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס מעיים ותיקון בעקבות פגיעה. תאי גזע המעי אחראים תאית שגשוג והמסירה של רירית אפיתל המעי. כאשר מבודד מן המעי נורמלי או פצוע, תאי גזע המעי יכול להישמר בתרבות, לשמש כלי או מודל לחקר תאי גזע וביולוגיה תאים אפיתל. השיטות לבודד ולהקים אלה תלת מימדי התרבות מערכות (הנקרא enteroids ו- colonoids כאשר נגזר מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה) תוארו עבור מגוון רחב של מינים ו עוגב מערכות9,10 ,11,12,13. באופן ספציפי, במסגרת מערכת העיכול, שימשו מערכות אלה תרבות למחלות במערכת העיכול מודל כולל סרטן, זיהום הפתוגן, מחלות מעי דלקתיות14. בשלב זה, ישנם דיווחים לא המתארת את הבידוד ואת התחזוקה של תאי גזע מעיים של המעי הדק פצוע ischemically של כל מין. לכן, כאן אנו מתארים את התהליך של איסכמיה מעיים במודל של הרומן, גדולים בעלי חיים חזירי שתוצאתה פגיעה לשחזור ואת היכולת לבודד תאי גזע מעיים מן המעי נורמלי ונפצעו ischemically לחקר נוספים שחזור ex-vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:640px;" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BP-399</td>
			<td style="width:167px;">Dilute 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Distilled, deionized water (ddH2O)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to prepare EDTA and PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">20688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">ED45</td>
			<td>Make fresh before each experiment; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Y-27632</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">N2 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">B-27 Supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">HEPES</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Glutamax</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-096</td>
			<td>Anti-Anti solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Wnt-3a</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">5036 WN/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Rspondin1</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">4645- RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:107px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">LY2157299</td>
			<td style="width:107px;">SelleckChem</td>
			<td align="right" style="width:119px;">52230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Cayman Chemical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Human [leu]15-Gastrin 1</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">SB202190</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">57067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">A83-01</td>
			<td style="width:107px;">Tocris</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Nicotinamide</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Water, WFI Quality</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td>Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Matrigel Matrix, GFR</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">356231</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">24 Well Culture Dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Conical Tube, 50 ml&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Scalpel Handle</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Carbon Steel Surgical Blade, No. 10</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">504169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">15918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Debakey Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501752</td>
			<td>Curved or straight</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Metzenbaum Scissors</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Mosquito Forceps, Curved</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503724-12</td>
			<td>Curved or straight (503728-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Hopkins Bulldog Clamp</td>
			<td style="width:107px;">Stoelting Co.</td>
			<td>52120-40P</td>
			<td>Straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Silk, 2-0&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">685S-BUT</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Towel Clamps</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td align="right">501700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Needle Holder</td>
			<td style="width:107px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">V503382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Wire suture, 20 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">19075</td>
			<td>Cut and straighten before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Surgical Towels</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">ST1833</td>
			<td>Any similar product is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Lactated Ringers Solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Chlorhex antiseptic scrub (4%)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">VINV-CHMX-SCRB</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isopropyl Alcohol 70%</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">MS071HS</td>
			<td>Any similar brand is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">IV catheter, 22 gauge</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">2225PUR</td>
			<td>May need 20g or 24 g depending on size of the vein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Xylazine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Ketamine (100 mg/ml)</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">11695-6835-1</td>
			<td>Controlled medication</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Isoflurane solution</td>
			<td style="width:107px;">Henry Schein</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10015516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))</td>
			<td style="width:107px;">Vortech Pharm.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Heating pad&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tpump Core Warming System; others are available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Mindray Datascope Monitor</td>
			<td style="width:107px;">Mindray North America</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Vetland Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Fluid Pump</td>
			<td style="width:107px;">Abbott Hospira</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia

איסכמיה מעיים נשאר הגורם העיקרי התחלואה והתמותה בחולים אנושיים והטיפול. תהליכי מחלה רבים לגרום איסכמיה מעיים, כאשר אספקת הדם והחמצן ולכן הוא ירד אל המעי. זה מוביל לפגיעה הרקמה הבסיסית ואובדן של מכשול המעי. תאי גזע מעיים שוכנים למרגלות המופרש והם אחראים על חידוש מעיים במהלך הומאוסטזיס ופציעה הבאים. Ex-vivo תא תרבות טכניקות אפשרו לצורך המחקר המוצלח של תאי אפיתל אינטראקציות על-ידי יצירת תנאים תרבות תומכת הצמיחה של מערכות איבר דמוי אפיתל תלת-ממדי (הנקרא "enteroids" " colonoids"מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה). Enteroids אלה הינם מורכב קריפטה ותחומים כמו סיסי בוגר כדי לכלול את כל סוגי תאים הנמצאים בתוך האפיתל. מבחינה היסטורית, מודלים מאתר כבר נעזרו ללמוד פגיעה במעיים. עם זאת, מודל חזירי מציע מספר יתרונות כולל הדמיון של גודל, כמו גם מערכת העיכול אנטומיה ופיזיולוגיה לזה של בני האדם. על ידי ניצול מודל חזירי, אנחנו לבסס פרוטוקול בו לולאות סגמנטלי של איסכמיה מעיים יכולים להיווצר בתוך חיה יחידה, המאפשרת לימוד שונות נקודות הפגיעה איסכמי זמן ותיקון vivo בתוך. בנוסף, אנו מתארים שיטה כדי לבודד את התרבות תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי של המעי, מתן אפשרות ללימודי המשך של תיקון אפיתל, מווסת על ידי תאי גזע, ex-vivo.

איסכמיה מעיים מלאה נוצר ב קטן לולאות מעיים באמצעות חסימת כלי דם עם תפר או מלחציים כמוצג באיור1. על ידי שחרור את התפסים, תקופה מבוקרת של פגיעה reperfusion יכול להתבצע, המאפשר לימוד נוספים של פגיעה reperfusion לאחר מכן פגיעה במידת הצורך. כל החיות שרדו במהלך ההליך עם סיבוך מינימלי עד המתת חסד. כירורגי. הסיבוך הנפוץ ביותר היה תת לחץ דם, אשר נפתרה עם תוספת של תייצב חיובי כגון dobutamine.
אם מבוצעת כהלכה, איסכמי מתחילים בקצה סיסי מעיים, להעביר למטה בתוך הקריפטה ככל שהמשך של איסכמיה גדל (איור 2). טעות נפוצה אחת עם טכניקה כירורגית עשויה להתרחש כאשר כלי הדם לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה. התוצאה היא איסכמיה מדמם (איור 3), שבו הווריד דקות קיר יתמוטט לפני העורק, התרת דם נוסף לחדור הרקמות. זה הוא לראות בגסות כהה סגול serosal משטח (איור 3, משמאל) לעומת משטח חיוורת במהלך מלאה איסכמיה (איור 3, ימין).
בעקבות הסרת של לולאות מעיים איסכמי, כוכים מעיים היו מבודדים בהצלחה בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה (איור 4). כצפוי, כוכים מ timepoints נפגע קשות יותר היו לעתים קרובות שבור (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. במהלך הפרוטוקול, בטח מנערים המעי נפגע קשות בעדינות כדי למנוע נזק נוסף הרקמה הבסיסית. רועד גם בערך יכול לגרום נזק התת-קרקעי נוסף, רוב כוכים גומרת בפתרונות ד ר המכילה EDTA, וכתוצאה מכך שיבושים נוספים.
ברגע מצופה, כוכים בין כל נקודות זמן איסכמיה לשרוד, הם מסוגלים להפוך הוקמה בתרבות (איור 5). מתי כוכים מעיים רגילה, המעטה פגום הם מצופה בתרבות, enterospheres טופס בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים מעיים לשרוד אך פגומים, וכתוצאה מכך להיווצרות של הספירות הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. בסך הכל, אין יעילות של צמיחה ירידה של כוכים, כמו גם גודל ירידה של enteroids נגזר רקמת המעי נפגע קשות (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> איור 1 : דגם כירורגי של איסכמיה מעיים מלאה במודל חזירי. א) מעי צם חזירי נורמלי אוזני. ב) כלי מצע המעי העליון יש כבר מאתרים בתפר יצירת איסכמיה מעיים. ג) איסכמיה שנוצרו באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג כדי לאפשר פגיעה reperfusion רקמות במידת הצורך. ד) להערכת המעי מיד לאחר הסרת התפסים כלי הדם. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> איור 2 : עדות היסטולוגית (hematoxylin ואאוזין (H & E) כתם) של הגדלת אפיתל נזק בעקבות המשכים ארוכים של איסכמיה מעיים מלאה. הנזק מתחיל בקצה סיסי עם אובדן הדרגתי של שכבת האפיתל תא בודד, סיסי blunting נזק תאי הארכת אל הקריפטה הבסיס עם פציעה קשה (משך h עד 4). בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> איור 3 : ראיות ברוטו היסטולוגיים של איסכמיה דימומית. A) תצלום מגעיל השוואת hemorrhagic איסכמיה (הלולאה שמאל) ו איסכמיה מלאה (נכון הלולאה). כאשר להערכת לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה, דם יכול להמשיך לחדור הרקמות, והתוצאה היא דלקת נוספים ונזק. ב) תמונות H & E של איסכמיה מדמם של הגדלת משך מ h 1-4. בנוסף נזק תאי אובחנה איסכמיה מלאה, יש עדויות של תאי הדם האדומים חדירה בתוך פרופריה. מוסקולריס שמסביב. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> איור 4 : Aliquots של המעי כוכים מבודד לולאות המעי איסכמי ונורמלי. כוכים מעיים, מלאה, שלמה (כוכביות) היו מבודדים בהצלחה של כל לולאה של מעי. כצפוי, כוכים מנקודות הזמן נפגע קשות יותר, לעיתים קרובות היו שבורות (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> איור 5 : מסלול הזמן צמיחת תאי המעי בעקבות בידוד מן לולאות איסכמי של המעי הדק. כאשר כוכים מעיים רגילה מצופים בתרבות, enterospheres נוצרו בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים לשרוד אך יוצרים כדורים הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. 20 מיקרומטר סולם בר אלא אם כן צוין. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>גורם גידול</td>
			<td>Diluent</td>
			<td>ריכוז מניות</td>
			<td>דילול מניות</td>
			<td>דילול עובד</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>µg 1/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10 מ מ חומצה אצטית</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>µg 500/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>מיקרומטר 500</td>
			<td>500 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>100 מיקרומטר</td>
			<td>10 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>5 מ מ</td>
			<td>0.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td>2.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>µg 200/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: טבלה ריאגנט Growth factor- סיכום של פתרונות מניות פקטורי גדילה ופתרונות עבודה בשימוש בפרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia at JoVE.com

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

10.7K Views.  North Carolina State University. פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

Video: Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

גזע השתלת תאים ב במבחנה דגם סימולציה איסכמיה / reperfusion

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Heterotopic Renal Autotransplantation in a Porcine Model: A Step-by-Step Protocol

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality of life when compared to dialysis. Although the last few decades have seen major improvements in patient outcomes following kidney transplantation, the increasing shortage of available organs represents a severe problem worldwide. To expand the donor pool, marginal kidney grafts recovered from extended criteria donors (ECD) or donated after circulatory death (DCD) are now accepted for transplantation. To further improve the postoperative outcome of these marginal grafts, research must focus on new therapeutic approaches such as alternative preservation techniques, immunomodulation, gene transfer, and stem cell administration.
Experimental studies in animal models are the final step before newly developed techniques can be translated into clinical practice. Porcine kidney transplantation is an excellent model of human transplantation and allows investigation of novel approaches. The major advantage of the porcine model is its anatomical and physiological similarity to the human body, which facilitates the rapid translation of new findings to clinical trials. This article offers a surgical step-by-step protocol for an autotransplantation model and highlights key factors to ensure experimental success. Adequate pre- and postoperative housing, attentive anesthesia, and consistent surgical techniques result in favorable postoperative outcomes. Resection of the contralateral native kidney provides the opportunity to assess post-transplant graft function. The placement of venous and urinary catheters and the use of metabolic cages allow further detailed evaluation. For long-term follow-up studies and investigation of alternative graft preservation techniques, autotransplantation models are superior to allotransplantation models, as they avoid the confounding bias posed by rejection and immunosuppressive medication.

Porcine models of organ transplantation provide an important platform to study mechanisms of organ preservation. This article describes a heterotopic porcine renal autotransplantation model, which allows investigating new approaches to improve the outcome of transplantation using marginal kidney grafts.

Heterotopic כליה Autotransplantation במודל חזירי: פרוטוקול צעד-אחר-צעד

Kidney transplantation is the treatment of choice for patients suffering from end-stage renal disease. It offers better life expectancy and higher quality ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Forskolin-induced נפיחות מעיים Organoids: An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay עבור הערכת תגובה לתרופה בחולי סיסטיק פיברוזיס

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

A Pre-clinical Rat Model for the Study of Ischemia-reperfusion Injury in Reconstructive Microsurgery

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many areas of biomedical research due to its cost-effectiveness and its translation to humans. This protocol describes a method to create a preclinical free skin flap model in rats with ischemia-reperfusion injury. The described 3 cm x 6 cm rat free skin flap model is easily obtained after the placement of several vascular ligatures and the section of the vascular pedicle. Then, 8 h after the ischemic insult and completion of the microsurgical anastomosis, the free skin flap develops the tissue damage. These ischemia-reperfusion injury-related damages can be studied in this model, making it a suitable model for evaluating therapeutic agents to address this pathophysiological process. Furthermore, two main monitoring techniques are described in the protocol for the assessment of this animal model: transit-time ultrasound technology and laser speckle contrast analysis.

Here, we describe a pre-clinical animal model for studying the pathophysiology of ischemia-reperfusion injury in reconstructive microsurgery. This free skin flap model based on the superficial caudal epigastric vessels in the rat may also allow for the evaluation of different therapies and compounds to counteract ischemia-reperfusion injury-related damage.

מודל מפרה קליני לחקר איסכמיה-reperfusion פציעה במיקרו-כירורגיה משחזרת

Ischemia-reperfusion injury is the main cause of flap failure in reconstructive microsurgery. The rat is the preferred preclinical animal model in many ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was not possible in classical cell culture monolayers. Moreover, monolayer cell cultures are good in vitro model systems but do not represent the complex cellular differentiation processes and functions that rely on 3D structure. This has so far only been possible in animal experiments, which are laborious, time consuming, and hard to assess by optical techniques. Here we describe an assay to quantitatively determine the barrier integrity over time in living small intestinal mouse organoids. To validate our model, we applied interferon gamma (IFN-&#947;) as a positive control for barrier destruction and organoids derived from IFN-&#947; receptor 2 knock out mice as a negative control. The assay allowed us to determine the impact of IFN-&#947; on the intestinal barrier integrity and the IFN-&#947; induced degradation of the tight junction proteins claudin-2, -7, and -15. This assay could also be used to investigate the impact of chemical compounds, proteins, toxins, bacteria, or patient-derived probes on the intestinal barrier integrity.

Here we describe a technique to quantify the barrier integrity of small intestinal organoids. The fact that the method is based on living organoids enables the sequential investigation of different barrier integrity modulating substances or combinations thereof in a time-resolved manner.

חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

הערכה בזמן אמת של מיקרופרפוזיה בחוט השדרה במודל חזירי של איסכמיה/רפרפוזיה

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. Here, we describe a protocol to generate a two-dimensional (2D) monolayer from three-dimensional (3D) non-human primate enteroids derived from intestinal crypts of the terminal ileum. These enteroid-derived monolayers were then utilized in an in vitro scratch wound assay to test the ability of hyaluronan 35 kDa (HA35), a human milk HA mimic, to promote cell migration and proliferation along the epithelial wound edge. After the monolayers were grown to confluency, they were manually scratched and treated with HA35 (50 &#181;g/mL, 100 &#181;g/mL, 200 &#181;g/mL) or control (PBS). Cell migration and proliferation into the gap were imaged using a transmitted-light microscope equipped for live-cell imaging. Wound closure was quantified as percent wound healing using the Wound Healing Size Plugin in ImageJ.&#160;The scratch area and rate of cell migration and the percentage of wound closure were measured over 24 h. HA35 in vitro accelerates wound healing in small intestinal enteroid monolayers, likely through a combination of cell proliferation at the wound edge and migration to the wound area. These methods can potentially be used as a model to explore intestinal regeneration in the preterm human small intestine.

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

This protocol describes a method to establish and perform a scratch wound assay on two-dimensional (2D) monolayers derived from three-dimensional (3D) enteroids isolated from non-human primate ileum.

ההשפעה של חומצה היאלורונית 35 kDa על מודל in vitro של פגיעה מוקדמת במעי הדק וריפוי באמצעות מונולרים שמקורם באנטרואיד

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...