我々は、目的の遺伝子にフロックス化対立遺伝子を有する正常マウス尿路上皮細胞のエクスビボ遺伝子編集を介して、膀胱癌オルガノイドを生成するための迅速かつ効率的なプロトコルを開発しました。このエクスビボ法は、何年ものマウス育種ではなく1〜2週間のワークフローを有し、Cre媒介遺伝子欠失に対するアデノウイルス形質導入において非常に効率的である。まず、はさみ、鉗子、DPBSを含むすべての滅菌器具および試薬を35ミリリットルの培養皿、70%エタノール、ガーゼ、および清潔なペーパータオルに調製する。
次に、解剖領域のすべての表面を清掃し、清浄なペーパータオルで解剖領域を覆う。安楽死させたマウスを解剖領域のガーゼの上に置き、マウスの腹部に70%エタノールを噴霧し、次いで滅菌解剖ハサミを用いて、下正中線腹部切開を行い、膀胱を露出させる。次に、鉗子を使用して膀胱をつかみ、静かに引き上げて、両側尿管腫接合部を特定します。
はさみを使用して、2つの尿管開口部の間の境界線に従って膀胱眼底を除去し、膀胱を2ミリリットルのDPBSを含む滅菌皿に移し、次いで脂肪および結合組織を除去し、膀胱を2ミリリットルのDPBSを含む新しい皿に入れる。また、マイナス80°Cの貯蔵庫からアデノウイルスを取り除き、氷の上に保管してください。細胞解離のために、原稿に記載されているようにすべての滅菌器具および試薬を準備し、次いでバイオセーフティキャビネット内で、膀胱を35ミリメートルの皿に移し、2ミリリットルの滅菌DPBSで洗浄する。
4匹のマウスから膀胱組織を、木炭を剥ぎ取ったFBSを含まない1ミリリットルの完全培養培地を含む皿に集める。次に、外科用ブレードを用いて、各膀胱を4つの等しい部分に細かく刻み込み、次いで鉗子を用いて、膀胱を広げて尿路上皮表面を媒体に露出させる。膀胱片および培地を15ミリリットルの遠沈管に移す。
木炭を剥ぎ取ったFBSを含まない2ミリリットルの完全培養液で皿を2回洗い、洗浄物を遠沈管に加え、総容量を5ミリリットルにする。次に、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ混合物を添加し、チューブを37°Cの眼窩シェーカーインキュベーターに水平に置き、200RPMで30分間培養した。組織消化後、等量の10%木炭剥離FBSおよびDPBSをチューブに加え、200倍gで5分間遠心分離する。
上清を捨てた後、2ミリリットルのトリプシン代替物を細胞ペレットに加え、よく混合し、次いでチューブを摂氏37度および5%二酸化炭素で4分間インキュベートする。インキュベーション後、標準のP1000チップで細胞を10回上下にピペットし、5ミリリットルの10%木炭ストリップFBSおよびDPBSを加えます。解離した細胞を100マイクロメートルの滅菌セルストレーナーを通してひずみ、細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに集める。
細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、200倍gで5分間遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを1ミリリットルの完全培養液に再懸濁する。血球計数器を用いて細胞数を計数し、プレートを0.5ミリリットルの新鮮な完全培養液で24ウェルプレートの各ウェルに10~6番目の細胞を10回加えた。
次に、マイナス20°Cの保存からエンゲルブレス・ホルム・スウォームマウス肉腫細胞のマトリックス抽出物を取り出し、氷上で解凍する。また、6ウェルプレートを摂氏37度の細胞培養器で予備加温する。アデノウイルス形質導入のために、2マイクロリットルのアデノウイルスを24ウェルプレートに加え、解離した尿路上皮細胞とよく混合する。
形質導入効果を高めるために、プレートを300倍gで30分間遠心分離し、次いでプレートを摂氏37度および5%二酸化炭素で1時間インキュベートすることによってスピノキュレーションを行う。細胞および培地をウェルから15ミリリットルのチューブに移し、200倍gで5分間遠心分離する。上清を捨てた後、50マイクロリットルの完全培養培地を加え、底部の細胞とよく混ぜる。
次に、140マイクロリットルのマトリックス抽出物を加え、気泡を避けるためによく穏やかに混合し、ドームあたり50マイクロリットルの溶液を予め温めた6ウェルプレートに素早く加えることによってオルガノイドのドームを作成する。プレートをインキュベートし、ドームを5分間固化させる。5分後、6ウェルプレートを裏返し、さらに25分間固化を続けます。
インキュベーション後、各ウェルに2.5ミリリットルの完全培養培地を加え、プレートをオルガノイド培養用のインキュベーターに入れます。緑色蛍光タンパク質はほぼ100%の細胞で検出され、アデノウイルスの形質導入の効率が高いことが示唆された。トリプルノックアウトオルガノイド腫瘍のヘマトキシリンおよびエオジン染色および免疫組織化学は、CK5およびp63の基底サブタイプマーカーの陽性タンパク質発現を有する高悪性度尿路上皮癌の形態を示した。
非組換えフロックス対立遺伝子は、アデノウイルスで未処理の尿路上皮細胞で検出されたが、組換え対立遺伝子はトリプルノックアウトオルガノイドで観察された。一般に、2センチメートルの皮下腫瘍を形成するのに2〜3週間が必要であった。トリプルノックアウトオルガノイドの免疫組織化学は、インビボ異種移植片、CK7、CK5、およびp63タンパク質の陽性発現を示した。
CK8およびウロプラキンタンパク質について陰性発現が検出された。間葉マーカーであるビメンチンは、腫瘍嚢または間質においてのみ検出された。マウス膀胱解離は30分を超えてはなりません。
より長い解離時間は、内皮細胞および線維芽細胞などの間質細胞の割合において増加し得るこのアプローチは、細胞選別または細胞型特異的アデノウイルスと組み合わせて、内腔対基底オルガノイドなどの細胞型の特定のオルガノイドを生成することができる。
