תרבית של אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן ככלי רפואה מדויקת

שיטה זו משמעותית מכיוון שאורגנואידים שמקורם בחולה מספקים כלי מהיר ורב עוצמה לחקר סרטן אורולוגי מכיוון שהם מחקים לעתים קרובות את ההטרוגניות הגנטית והפנוטיפית של מחלה רב-ספקטרום זו. אורגנואידים יכולים להיות מבודדים מכמות מוגבלת של חומר ביופסיה של המטופל וניתן להרחיב אותם במהירות לניתוח במורד הזרם. האורגנואידים הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש הן כמודלים שיעזרו לנו להבין את הבסיס התאי והמולקולרי של סרטן אורולוגי והן ככלי לרפואה מדויקת כדי לאפשר לנו לחזות לאילו טיפולים וחולים בודדים סרטן עשויים להגיב.

כדי להתחיל, לאסוף דגימת גידול מקרוסקופית טרייה בת קיימא מניתוח ולוודא כי הדגימה שקועה במדיום הובלה בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר או בצנצנת דגימת שתן במהלך המעבר. רשום פרטי דגימה הכוללים משקל רקמה, תיאור דגימה ופרטים לגבי דגימות דם ושתן כלשהן בגיליון עיבוד הדגימות של המטופל. החלף בזהירות את מדיום ההובלה ב -10 מיליליטרים של מדיה בסיסית ואפשר לרקמת הגידול להתיישב בכוח הכבידה.

לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר את רקמת הגידול ולהניח אותו בצלחת פטרי סטרילית 90 מילימטר. רשום את משקל הרקמה בגרמים או במיליגרם על גיליון עיבוד הדגימה הקלינית ורשת הדיסקציה. לאחר מכן באמצעות מלקחיים סטריליים בלהב אזמל חד פעמי המורכב על ידית אזמל, הסר את הרקמה הלא סרטנית ואזורים נמקיים הנראים באופן מקרוסקופי.

לשטוף את חתיכות הגידול פעם או פעמיים עם DPBS קר, ולאחר מכן לאסוף ולהעביר אותם לצלחת פטרי סטרילית חדשה 90 מילימטרים. צלם תמונה, צייר דיאגרמת רקמה ותכנן את כריתת הרקמה על רשת עיבוד קלינית. לצורך ניתוח היסטופתולוגי, מקם כ -50 מיליגרם של רקמת הגידול לתוך קלטת היסטולוגיה פלסטית חד פעמית מסומנת.

לאחר מכן טבלו את קלטת ההיסטולוגיה למיכל עם נפח של פי 5 עד פי 10 של 10% פורמלין נייטרלי ודגירה בן לילה. למחרת, החליפו את הפורמלין ב-70% אתנול לאחסון בארבע מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לעבד את הרקמה. לצורך אנליזה מולקולרית, הצמד מקפיא לפחות חתיכת גידול אחת ב- RNase, DNase חופשי 1.5 מיליליטר קריוביאל באמצעות חנקן נוזלי ומאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, מחלקים חמישה מיליליטרים של מדיום אורגנואידי בצלחת פטרי של 90 מילימטר המכילה את חלקי הגידול הנותרים וטחנו באופן מכני את הרקמה בסדר ככל האפשר. באמצעות להב אזמל סטרילי מספר 10. מעבירים את הרקמה הטחונה דק לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומוסיפים ארבעה מיליליטרים של מדיום אורגנואידי, מיליליטר אחד של 10X קולגן/היאלורונידאז ו-0.1 מיליגרם למיליליטר DNase I כדי למנוע גוש תאים.

דגירה של רקמת הגידול הטחונה בתמיסת אנזים למשך שעה עד שעתיים על שייקר מסלולי או סיבוב באינקובטור כדי לנתק שברי תרחיף של תאים ולפרק קולגן. לאחר מכן לעצור את העיכול על ידי הוספת נפח כפול של מדיום בסיסי למדגם. צנטריפוגה את הדגימה, לשאוף, ולהשליך את supernatant.

לאחר מכן, כדי ליז את תאי הדם האדומים המזהמים, יש לגדל את הכדור בחמישה מיליליטרים של חיץ אשלגן אמוניום כלוריד ולדגום את הצינור בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות או עד שתראה את התזה המלאה של תאי הדם האדומים. לאחר מכן הוסף 20 מיליליטרים של תווך בסיסי לתוך הצינור. צנטריפוגה שוב ושואפת את הסופרנאטנט.

בשלב זה, הניחו אליקווט של 10 מיליליטר של 2X ו-1X אורגנואידים בינוני באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי להתחמם. סנן את הדגימה תחילה דרך מסננת 100 מיקרון הפיכה רטובה מראש לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר כדי להסיר חומר גדול ובלתי מסיס. לאחר מכן סנן את האלוט דרך מסננת הפיכה טרום-רטובה של 37 מיקרון כדי לאסוף תאים בודדים באשכולות קטנים לבידוד של תאים בודדים ותאים חיסוניים.

לאחר מכן, הפכו את מסננת ה-37 מיקרון והוסיפו 10 מיליליטרים של מדיה בסיסית כדי לאסוף אשכולות קטנים ובינוניים. מלאו כל אחד מצינורות 50 מיליליטר החדשים האלה עם DPBS ל-40 מיליליטרים, ואז צנטריפוגה במתלים והשליכו את ה-supernatant. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטרים של מדיה בסיסית לצינור המכיל את התאים הבודדים וספור את התאים באמצעות צבע הרחקה כחול טריפאן במונה תאים אוטומטי.

קבע את מספר התא ואת הכדאיות של התאים. צנטריפוגה את הדגימה הנותרת ולהחליף את המדיום בתמיסת הקפאת תאים או במצע בסיסי המכיל 10% סרום בקר עוברי 1%פניצילין וסטרפטומיצין ו-10%DMSO, ואז מניחים את הדגימות בקריוביאלים של 1.5 מיליליטר, מאחסנים אותן במיכל הקפאה עצמית, ומעבירים מיד את המכלים למקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הקריוביציאלים לנוזל קריוגני או לאחסון בפאזת האוויר לאחסון לטווח ארוך.

לאחר מכן, החיזרו את האשכולות הקטנים והבינוניים שנאספו עם 500 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי 2X שחומם מראש. לאחר מכן עם קצות פיפטה של מסנן סטרילי P-1000 קר כקרח, מוסיפים BME לתאים ומערבבים בעדינות. פיפט במהירות ובזהירות פיפט 100 מיקרוליטרים של תערובת BME של התאים המשוחזרים לבארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד, בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות, ומניחים את הצלחת באינקובטור למשך 20 עד 30 דקות כדי להתמצק.

לאחר הדגירה מוסיפים מדיום אורגנואידי על גבי תרחיף תאי ה-BME ביחס של אחד עד שניים בהתאם לנפח המוערך אמפירית, ומניחים את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות כדי להתאזן. לאחר הדגירה, הסר את הצלחת מהאינקובטור והרכב אותה על מחזיק דגימה על שלב המיקרוסקופ כדי להעריך אורגנואידים באופן חזותי תחת ניגודיות פאזה או הגדרות שדה בהיר. שדרגו את המדיום כל יומיים-שלושה באמצעות 50 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי שחומם מראש כדי לחדש את גורמי הגדילה המדולדלים ואת הנפח הכולל.

רכשו את תמונות הסדרה בהילוך מהיר בימים 1, 2 ו-3, ו-5, 7 ו-10 לפני המעבר. עיכול של שעתיים של רקמת סרטן שלפוחית השתן עם קולגן/היאלורונידאז ו-DNase I הזמינים מסחרית מוביל לעיכול מספיק של 0.5 עד 1 מילימטר מעוקב חתיכות של רקמת ביופסיה מורכבת יותר של כריתת ציסטה, כולל התאים הניאופלסטיים בתוך הלמינה פרופריה ושכבות השרירים של שלפוחית השתן. שברי עיכול גדולים יותר מתאימים לתרבית ולצלחות תרבית רקמה סטנדרטיות בכל גודל כדי לבודד תרביות דו-ממדיות חדשניות.

אורגנואידים הנוצרים על ידי הליך זה עוברים הרכבה עצמית דינמית, כולל שלבים של צבירה, דחיסה והיווצרות סופית של מבנים תאיים הדוקים. מבחינה היסטולוגית, מבנים אלה משחזרים את הגידול המקורי של החולה. אורגנואידים הנוצרים בהליך זה מתאימים למטרות רבות, כולל אפיון היסטופתולוגי נוסף, ביובנקינג ובדיקות יעילות תרופות.

לאחר יצירת אורגנואידים, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כדי ליצור פרופיל של גידולים אלה, כולל תפקידם של טיפולים אנטי-סרטניים, פרופיל מטבולי או פרופיל שעתוק. במסגרת תלת-ממדית זו, מתודולוגיות נוספות אלה מספקות תובנות רבות עוצמה על הביולוגיה של סרטן שלפוחית השתן. שיטה זו היוותה בסיס חשוב למחקרים שחקרו אימונונקולוגיה ומטבוליזם תאי.